第一章 绪论1酶：是具有生物催化功能的生物大分子，分为蛋白类酶和核酸类酶两大类别。酶的生产：是指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。酶的改性：是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶的固定化、酶非水相催化和定向进化。酶的应用：是通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等2酶催化的作用特点：专一性强、催化效率高和作用条件温和等。 酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。在酶的应用过程中，必须控制好各种环境条件，以充分发挥酶的催化功能。 3 米氏方程：V=VmS/Km+S,Km为米氏常数，是酶催化反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度。抑制剂的影响：有可逆抑制剂和不可逆抑制剂之分。 不可逆抑制剂与酶分子结合后，抑制剂难于除去，酶活性不能恢复。 可逆抑制剂与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶酶活力即可恢复。可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。竞争性抑制：是指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。抑制的效果强弱与竞争性抑制剂的浓度、底物浓度以及抑制剂和底物与酶的亲和力大小有关，随着底物浓度增加，酶的抑制作用减弱。特点：酶催化反应的最大反应速率Vm不变，米氏常数Km增大。非竞争性抑制：是指抑制剂与底物分别于酶分子上的不同位点结合而引起酶活性降低的抑制作用。特点：最大反应速度Vm减少，米氏常数Km不变。反竞争性抑制：在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用称为反竞争性抑制。特点：最大反应速度Vm和米氏常数Km同时减少。4酶的活力测定酶活力：是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。在外界条件相同的情况下，反应速度越大，意味着酶活力越高。酶活力测定过程：反应体系选择 、反应条件确定、反应物检测、酶活力计算、偶联酶反应活力测定酶活力单位：在特定条件下（温度可采用25或其它选用的温度，pH等条件均采用最适条件），每1 min 催化1 mol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位。这个单位称为国际单位。 酶的转换数：是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数，即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。酶的生产方法：提出分离法、生物合成法、化学合成法第二章 微生物发酵产酶酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程，称为酶的发酵生产。产酶微生物的特点：酶的产量高；产酶稳定性好；容易培养和管理；利于酶的分离纯化；安全可靠、无毒性。酶的发酵生产方式：固体培养发酵、液体深层发酵、固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵。酶发酵动力学：是研究发酵过程中细胞生长效率、产物生成效率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的学科。 一、细胞生长动力学 在分批培养过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。1950年，法国莫诺德首先提出了表述微生物细胞生长的动力学，他认为，在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比。营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型:比生长速率（1/h） （specific growth rate）max：最大比生长速率（1/h）S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/LKs：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，或 mol/L二、产酶动力学 （一） 酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为4种模式，即：同步合成型、中期合成型、延续合成型、滞后合成型1. 同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。2 中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。3 延续合成型：酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。 所对应的mRNA相当稳定。3. 滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。 所对应的mRNA稳定性高。酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度 。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。酶的发酵工艺条件与控制： 1、培养基培养基的基本成分五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水2、发酵条件及控制：pH值的控制：培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。通常培养条件：细菌与放线菌：pH77.5酵母菌和霉菌：pH4.56范围内生长细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。 温度的控制：通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。 溶解氧的控制溶解氧：是指溶解在培养基中的氧气。在酶的发酵生产过程中， 处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。 培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。控制溶解氧方法：调节通气量、调节氧的分压 、调节气液接触时间 、调节气液接触面积 、改变培养液的性质 3、提高产酶的措施（1）添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。 诱导物一般可以分为3类：酶的作用底物、酶的催化反应产物、作用底物的类似物（2）控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。 （3）添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。 将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。 （4）添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高120倍；添加聚乙烯醇可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。 第四章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化：是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的技术过程，主要包括细胞破碎、提取、离心分离等等。细胞破碎：是指通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程。细胞破碎方法与其原理分类 细胞破碎方法 细胞破碎原理 机械破碎法 捣碎法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞 研磨法 破碎 匀浆法物理破碎法 温度差破碎法 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞 压力查破碎法的外层结构破坏，从而使细胞破碎 超声波破碎法化学破碎法 添加有机溶剂 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使 添加表面活性剂 细胞破碎酶促破碎法 自溶法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化 外加酶制剂法 作用，使外层结构受到破坏，从而使细胞破碎酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶从细胞、细胞碎片或其他含酶原料中提取酶的过程受到扩散作用的影响。提高温