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资源描述
一、 实验名称:重组DNA技术二、实验目的:1. 了解掌握DNA重组技术理论基础;2. 掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法;3. 掌握连接产物的转化方法及操作;4. 掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法;三、实验原理:1. 重组DNA技术重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,对各种生物的核酸(基因)进行改造和重新组合,然后导入微生物或真核细胞内,使重组基因在细胞内表达,产生出人类需要的基因产物,或者改造、创造新特性的生物类型的技术。它主要包括以下几个步骤:目的基因的获取:主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。cDNA文库是以mRNA为模板,利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA,再复制成双链cDNA片段,与适当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所有cDNA信息,总称cDNA文库 。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组DNA文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后,与适当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所有基因组DNA信息,因此称为基因组DNA文库。基因载体的选择与构建:常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。分为克隆载体和表达载体。克隆载体:用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。表达载体:用于在宿主细胞中表达外源目的基因,获得大量表达产物。选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。目的基因与载体的拼接:通过粘性末端连接法(同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接)、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。重组DNA分子导入受体细胞:将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞,主要有以下几种方法:a、转化:将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌),并使其获得新的表型的过程。b、转染:将外源DNA导入真核细胞的过程。c、感染:以噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子,在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒,才能感染适当的细胞,并在细胞内扩增。重组体的筛选:可通过遗传标记如抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记(PCR、分子杂交)等直接筛选或是根据免疫化学法、酶联免疫检测法等进行间接筛选。 无性繁殖转化子(含重组分子的受体细胞)目的基因的表达2、质粒酶切及鉴定原理限制性内切酶是一种工具酶,其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力,能在这个特异性核苷酸序列内,切断DNA双链,形成一定长度的DNA序列。根据限制性内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、三类, II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活,酶在其识别序列内切割双链DNA,产生的各种DNA片段具有相同的末端结构,而且大多数的II型酶可提供粘性未端,有利于片段再连接,限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此,鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。本实验采用的限制性内切酶是Bam HI和Hind III。 对于DNA回收,回收的目的是为了纯化提取的质粒,以用于以后的分子杂交、重组质粒的构建、序列分析等。目前常用的回收技术有:柱纯化回收法、电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、DEAE滤膜插片法等,其中柱纯化回收法、电洗脱法,经济节省,操作方便,对DNA回收效果好。本实验采用试剂盒回收(柱纯化回收法),其原理是采用凝胶裂解液融化凝胶,采用特殊的收集管收集DNA后,漂洗液洗脱杂质,最后用洗脱液洗出DNA。四、主要实验仪器:不同规格移液器、EP管、常规电泳仪、紫外灯、恒温水浴箱、常规台式离心机、恒温孵箱、CP3吸附柱、收集管、培养皿、酒精灯、玻璃涂布棒等。五、主要实验试剂:1. 酶切相关试剂:pUC18DNA、DNA(TIANGEN, MD202)、Hind III(Thermo, ER0501)、Buffer R (10X) (Thermo, BR5)、BamHI(Thermo, ER0051)、BamHI-Lsp1109I Buffer (10X)(Thermo, B57)、pUC18-mir203 质粒DNA (老师提供)。2.电泳相关试剂:琼脂糖、GoldView、1kb DNA Ladder(TIANGEN, MD111)、DNA电泳loading buffer(6X)(TIANGEN, RT201-01),电泳缓冲液。3、凝胶DNA回收:小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(庄盟国际生物,ZP202)。4. 重组体构建相关试剂:T4 DNA连接酶(Thermo, EL0014)、10X T4 DNA连接buffer( Fermentas, 00044933)。5. 转化相关试剂:感受态细胞(本实验用感受态细胞DH5从公司购买)、LB培养基(老师提供)、含Amp琼脂糖平皿(老师提供)、质粒小量提取试剂盒(庄盟国际生物,ZP101)、ddH2O等。六、实验步骤:1. 载体pUC18和目的DNA酶切(1)质粒DNA酶切反应体系:试剂体积 (ul)pUC18DNA (5ug)2.510buffer2Hind (15U)5ddH2O10.5total 20反应条件:37恒温水浴, 2hr;室温下放置等待连接。(2)目的DNA酶切反应体系:试剂体积 (ul)DNA(5ug)1010buffer2Hind III(9U)3ddH2O5total 20反应条件:37恒温水浴, 2hr;(3)质粒载体双酶切反应体系:试剂体积 (ul)pUC18-mir203 质粒DNA(4g) 2510buffer5Hind III(9U)2Bam HI 1ddH2O17total 50反应条件:37恒温水浴, 2hr;根据以上反应体系配制好后,瞬时离心后置于37恒温水浴锅中反应。2. 目的DNA酶切片段电泳鉴定(1) 配制1%琼脂糖凝胶:称取0.5克琼脂糖,置于锥形瓶内,加入50ml 1TAE,瓶口用保鲜膜封盖,在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解,得到1 %琼脂糖凝胶液,待其冷却至65左右,加入2.5 L GoldView。小心混匀并倒在制胶槽中,控制灌胶速度,使胶液缓慢展开,避免产生气泡,待胶凝固完全后,轻轻拔出梳子。将凝胶放入电泳槽中,加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液,准备电泳。(2) 电泳:取20uL酶切后产物,加入4uL DNA电泳loading buffer混匀,上样20uL。恒压90V电泳40-60min。(3) 紫外灯下观察结果并切胶用于后续试验。3.目的DNA凝胶条带切割及目的DNA回收根据试剂盒说明书操作(1)将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中,称取重量,约0.3g。 (2)向胶块中加入3倍体积溶胶液(900 l),55,水浴10分钟左右,其间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。(3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中 (吸附柱放入收集管中),12,000 rpm (13,400g )离心 1 分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。(4)向吸附柱中加入 600 l 漂洗液 W2 (使用前加入无水乙醇),12,000 rpm (13,400g )离心 1 分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。(5)向吸附柱中加入 500 l 漂洗液 W2,12,000 rpm (13,400g )离心 1 分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。 (6)将吸附柱放入收集管中,12,000 rpm (13,400g )离心 2 分钟,尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟,彻底晾干。 (7)将吸附柱放入一个干净离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加50l 的洗脱缓冲液 TE,12,000 rpm (13,400g )离心 1 分钟,收集 DNA 溶液。4. 连接目的DNA和酶切后的质粒DNA 反应体系:试剂体积 (ul)pUC18质粒载体2目的DNA2T4 DNA连接酶110buffer1ddH2O4total10配置好以上反应体系,瞬离混匀后,室温,过夜。5. 转化(1)-70冰箱取出感受态细胞DH5,冰浴中融化。(2)在1.5ml Ep管中加入50lDH5感受态细胞和2l的DNA溶液,温和混匀后置于冰上30min。(3)将菌液再置于42水浴中热激90s后冰浴2min。(4)然后加入900ul LB液体培养基,置于37恒温摇床上复苏3h(160rpm)。(5)菌液4000r/min离心2敏后。留下200uL上清液将菌体打散,并均匀涂布在预先准备好的含Amp的LB固体培养皿上,15min后,待菌液被培养基吸收后,倒置放于37培养箱中培养过夜。(6)待细菌生长16h左右时,LB培养基表面长出肉眼可见的菌落,此时用灭菌后的枪头挑取单一细菌克隆,置于含Amp的LB液体培养基(15mL)离心管,37恒温摇床过夜培养(160rpm)。6. 阳性重组子的克隆待细菌生长16h左右时,LB培养基表面长出肉眼可见的菌落,此时用灭菌后的枪头挑取单一细菌克隆(以小枪头挑轻触菌落即可),连同枪头一起放入盛约3ml的LB培养基的15ml规格离心管中,37恒温摇床过夜培养(160rpm)。7. 阳性重组子的酶切鉴定(1)质粒提取(根据试剂盒说明书操作)a. 收集菌体:取 1.5 ml 过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心机, 12,000 rpm (13,400g ) 离心 1 分钟,保留沉淀,尽量吸除上清。b. 重悬菌体:向留有菌体沉淀的离心管中加入 250 l 溶液 1(使用前加入 RNaseA),用移液枪吹打彻底悬浮细菌沉淀。c. 裂解菌体:向离心管中加入 250 l 溶液 2,温和地上下翻转 68 次使菌体 充分裂解。 注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免打断基因组 DNA,造成提取的质粒 中混有基因组 DNA 片断。d. 沉淀除杂:向离心管中加入 350 l 溶液 3,立即温和地上下翻转 68 次,充 分混匀,即出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (13,400g )离心 10 分钟,此 时在离心管底部形成沉淀。e. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中 (吸附柱放入收集管中),注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm (13,400g) 离心 30-60 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。 注意:溶液 3 加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小 白色沉淀,可再次离心后取上清。f. 向吸附柱中加入 700 l 漂洗液 W2 (请检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm (13,400g )离心 30-60 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集 管中。 g. 向吸附柱中加入 500 l 漂洗液 W2,12,000 rpm (13,400g )离心 30-60 秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。 h. 将吸附柱放入收集管中, 12,000 rpm (13,400g) 离心 2 分钟,目的是将吸 附柱中残余的漂洗液去除。 注
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