一、 实验名称：重组DNA技术二、实验目的：1. 了解掌握DNA重组技术理论基础；2. 掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法；3. 掌握连接产物的转化方法及操作；4. 掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法；三、实验原理:1. 重组DNA技术重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型的技术。它主要包括以下几个步骤：目的基因的获取：主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。cDNA文库是以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库 。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组DNA文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，因此称为基因组DNA文库。基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。分为克隆载体和表达载体。克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。表达载体：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物。选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。目的基因与载体的拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。重组DNA分子导入受体细胞：将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞，主要有以下几种方法：a、转化：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程。b、转染：将外源DNA导入真核细胞的过程。c、感染：以噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。重组体的筛选：可通过遗传标记如抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）等直接筛选或是根据免疫化学法、酶联免疫检测法等进行间接筛选。 无性繁殖转化子(含重组分子的受体细胞)目的基因的表达2、质粒酶切及鉴定原理限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA双链，形成一定长度的DNA序列。根据限制性内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、三类， II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA片段具有相同的末端结构，而且大多数的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。本实验采用的限制性内切酶是Bam HI和Hind III。 对于DNA回收，回收的目的是为了纯化提取的质粒，以用于以后的分子杂交、重组质粒的构建、序列分析等。目前常用的回收技术有：柱纯化回收法、电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、DEAE滤膜插片法等，其中柱纯化回收法、电洗脱法，经济节省，操作方便，对DNA回收效果好。本实验采用试剂盒回收（柱纯化回收法），其原理是采用凝胶裂解液融化凝胶，采用特殊的收集管收集DNA后，漂洗液洗脱杂质，最后用洗脱液洗出DNA。四、主要实验仪器：不同规格移液器、EP管、常规电泳仪、紫外灯、恒温水浴箱、常规台式离心机、恒温孵箱、CP3吸附柱、收集管、培养皿、酒精灯、玻璃涂布棒等。五、主要实验试剂：1. 酶切相关试剂：pUC18DNA、DNA（TIANGEN, MD202）、Hind III（Thermo, ER0501）、Buffer R (10X) （Thermo, BR5）、BamHI（Thermo, ER0051）、BamHI-Lsp1109I Buffer (10X)（Thermo, B57）、pUC18-mir203 质粒DNA （老师提供）。2.电泳相关试剂：琼脂糖、GoldView、1kb DNA Ladder（TIANGEN， MD111）、DNA电泳loading buffer（6X）（TIANGEN, RT201-01），电泳缓冲液。3、凝胶DNA回收：小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（庄盟国际生物，ZP202）。4. 重组体构建相关试剂：T4 DNA连接酶(Thermo, EL0014)、10X T4 DNA连接buffer( Fermentas, 00044933)。5. 转化相关试剂：感受态细胞（本实验用感受态细胞DH5从公司购买）、LB培养基（老师提供）、含Amp琼脂糖平皿（老师提供）、质粒小量提取试剂盒（庄盟国际生物，ZP101）、ddH2O等。六、实验步骤：1. 载体pUC18和目的DNA酶切（1）质粒DNA酶切反应体系：试剂体积 (ul)pUC18DNA (5ug)2.510buffer2Hind (15U)5ddH2O10.5total 20反应条件：37恒温水浴， 2hr；室温下放置等待连接。（2）目的DNA酶切反应体系：试剂体积 (ul)DNA(5ug)1010buffer2Hind III(9U)3ddH2O5total 20反应条件：37恒温水浴， 2hr；（3）质粒载体双酶切反应体系：试剂体积 (ul)pUC18-mir203 质粒DNA(4g) 2510buffer5Hind III(9U)2Bam HI 1ddH2O17total 50反应条件：37恒温水浴， 2hr；根据以上反应体系配制好后，瞬时离心后置于37恒温水浴锅中反应。2. 目的DNA酶切片段电泳鉴定（1） 配制1%琼脂糖凝胶：称取0.5克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到1 %琼脂糖凝胶液，待其冷却至65左右，加入2.5 L GoldView。小心混匀并倒在制胶槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子。将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液，准备电泳。（2） 电泳：取20uL酶切后产物，加入4uL DNA电泳loading buffer混匀，上样20uL。恒压90V电泳40-60min。（3） 紫外灯下观察结果并切胶用于后续试验。3.目的DNA凝胶条带切割及目的DNA回收根据试剂盒说明书操作（1）将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量，约0.3g。 （2）向胶块中加入3倍体积溶胶液（900 l），55,水浴10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中 （吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (13,400g )离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。（4）向吸附柱中加入 600 l 漂洗液 W2 （使用前加入无水乙醇），12,000 rpm (13,400g )离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。（5）向吸附柱中加入 500 l 漂洗液 W2，12,000 rpm (13,400g )离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 （6）将吸附柱放入收集管中，12,000 rpm (13,400g )离心 2 分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。 （7）将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50l 的洗脱缓冲液 TE，12,000 rpm (13,400g )离心 1 分钟，收集 DNA 溶液。4. 连接目的DNA和酶切后的质粒DNA 反应体系：试剂体积 (ul)pUC18质粒载体2目的DNA2T4 DNA连接酶110buffer1ddH2O4total10配置好以上反应体系，瞬离混匀后，室温，过夜。5. 转化（1）-70冰箱取出感受态细胞DH5，冰浴中融化。（2）在1.5ml Ep管中加入50lDH5感受态细胞和2l的DNA溶液，温和混匀后置于冰上30min。（3）将菌液再置于42水浴中热激90s后冰浴2min。（4）然后加入900ul LB液体培养基，置于37恒温摇床上复苏3h（160rpm）。（5）菌液4000r/min离心2敏后。留下200uL上清液将菌体打散，并均匀涂布在预先准备好的含Amp的LB固体培养皿上，15min后，待菌液被培养基吸收后，倒置放于37培养箱中培养过夜。（6）待细菌生长16h左右时，LB培养基表面长出肉眼可见的菌落，此时用灭菌后的枪头挑取单一细菌克隆，置于含Amp的LB液体培养基（15mL）离心管，37恒温摇床过夜培养（160rpm）。6. 阳性重组子的克隆待细菌生长16h左右时，LB培养基表面长出肉眼可见的菌落，此时用灭菌后的枪头挑取单一细菌克隆（以小枪头挑轻触菌落即可），连同枪头一起放入盛约3ml的LB培养基的15ml规格离心管中，37恒温摇床过夜培养（160rpm）。7. 阳性重组子的酶切鉴定（1）质粒提取（根据试剂盒说明书操作）a. 收集菌体：取 1.5 ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机， 12,000 rpm (13,400g ) 离心 1 分钟，保留沉淀，尽量吸除上清。b. 重悬菌体：向留有菌体沉淀的离心管中加入 250 l 溶液 1（使用前加入 RNaseA），用移液枪吹打彻底悬浮细菌沉淀。c. 裂解菌体：向离心管中加入 250 l 溶液 2，温和地上下翻转 68 次使菌体 充分裂解。 注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组 DNA，造成提取的质粒 中混有基因组 DNA 片断。d. 沉淀除杂：向离心管中加入 350 l 溶液 3，立即温和地上下翻转 68 次，充 分混匀，即出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (13,400g )离心 10 分钟，此 时在离心管底部形成沉淀。e. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中 （吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm (13,400g) 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 注意：溶液 3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小 白色沉淀，可再次离心后取上清。f. 向吸附柱中加入 700 l 漂洗液 W2 （请检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (13,400g )离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集 管中。 g. 向吸附柱中加入 500 l 漂洗液 W2，12,000 rpm (13,400g )离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 h. 将吸附柱放入收集管中, 12,000 rpm (13,400g) 离心 2 分钟，目的是将吸 附柱中残余的漂洗液去除。 注