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鸭肉双向电泳一 、溶液配制:1 裂解液:(猪肉,外文MS 2005年) extraction buffer 20ml7M urea 72010-360.06 = 8.4084g2M thiourea22010-376.12 = 3.0448g1%(w/v)DTT 1%20 = 0.2g 2%(w/v)CHAPS 2%20 = 0.4g40mM Tris 4010-32010-3121.14= 0.0969g5mM Pefabloc1mM EDTA(EDTA-2Na) 110-32010-3372.24 = 0.00744g0.8% carrier ampholytes 0.8%20 ml= 0.16ml 裂解液:(大弹涂鱼肝脏组织,中文生命科学仪器2009) extraction buffer 20ml7M urea 72010-360.06 = 8.4084g2M thiourea 22010-376.12 = 3.0448g4%(w/v)CHAPS 4%20 = 0.8g40mM Tris 4010-32010-3121.14= 0.0969g用前每ml加 0.01gDTT 0.01g/ml10L TBP 10L/ml5L两性电解质 5L/ml10L PMSF 10L/ml2L EDTA 2L/ml10L亮肽素 10L/ml10L抑肽素 10L/ml2 水化液:(猪肉,外文MS 2005年) 20ml7M urea 72010-360.06 = 8.4084g2M thiourea 22010-376.12 = 3.0448g2%(w/v)CHAPS 2%20 = 0.4g5mM Pefabloc 0.2%(w/v)DTT 0.2%20 = 0.04g0.2% carrier ampholytes 0.2%20 = 0.04ml 水化液:(大弹涂鱼肝脏组织,中文生命科学仪器2009) 20ml7M urea 72010-360.06 = 8.4084g2M thiourea 22010-376.12 = 3.0448g4%(w/v)CHAPS 4%20 = 0.8g 65mmol/ L DTT 6510-32010-3154.25= 0.2005g0.001% 溴酚蓝 0.001%20 = 0.0002g0.2% carrier ampholytes 0.2%20 = 0.04ml水化液:双向电泳实验指南 50ml 8M urea 85010-360.06= 24g 4%CHAPS 4%50 = 2g 0.0002%溴酚蓝 0.0002%50 = 0.0001g 0.2%Carrier Ampholytes 0.2%50 = 0.1ml(使用前加)50mM DTT 5010-35010-3154.25 = 0.3856g二 、样品制备: 猪肉:50mg+1ml EB 在Eppendorf管中,用Retsch MM2 agitator 仪器4下匀浆1h。提取物在10000g,10下离心1h。收集上清液,测定浓度。 大弹涂鱼肝脏组织:取出大弹涂鱼肝脏组织,放入加有液氮的陶瓷研钵中,研磨成粉末状;快速称取0.2 g与1 ml的裂解液混合,震荡混匀,4 静置2 -3 h,静置期间每半小时颠倒混匀一次。12000 r/ min 离心40 min,取上清液;再15000 r/ min 离心60 min,取上清液。三、上样量 分析型:100ug 总上样体积350ul,150ul样品,200ul水化液 样品与胶条接触1小时后,加上矿物油覆盖胶条。四、 水化主动溶胀五、等电聚焦 有三种升压模式:快速、线性和慢速 采用何种升压模式由IPG胶条、溶胀缓冲液和样品的共同电阻决定。猪肉:电压逐渐升高到10000V,直至达到总的60000V.h。大弹涂鱼肝脏组织:50 V 主动水化14 h250 V线性除盐1.5 h500 V线性除盐1.5 h4500 V线性升压6 h4500V 快速聚焦25000 V-hr500 V 保持等电聚焦后的胶条可在-20长期保存,不会影响最终的双向电泳凝胶图像六 平衡: 平衡母液: 100ml6M urea 610010-360.06 = 36g 20%(v/v) glycerol (甘油) 20%100 = 20ml 2% (w/v) SDS 2%100 = 2g 50mM Tris 5010-310010-3121.14 = 0.6057g 平衡液:1% (w/v)DTT 还原蛋白巯基,使用前现配,10ml加200mgDTT。终浓度2%。平衡液:2.5%(w/v) 碘乙酰胺 巯基烷基化,加入碘乙酰胺,10ml加250mg。 终浓度2.5% 每个槽中放入一根胶条,胶面朝上。向槽中注满用平衡母液配置的平衡液进行反应。首先,DTT平衡液中摇荡10min,弃掉平衡液;然后,注入碘乙酰胺平衡液同样平衡10min,平衡过后取出IPG胶条。17cm的胶条4.5ml七 SDS-PAGE 电泳 按照IPG胶条电极与电泳槽电极相一致的原则,将平衡好的胶条,放置在凝胶上,用预溶的0.5%低熔点琼脂糖封胶,轻压IPG胶条,使其与SDS凝胶充分接触,排除其间小空泡,在室温中静置,直到低熔点琼脂糖凝固。将凝胶转移到电泳槽中,加入缓冲液,设置电泳运行条件:起始电压80V,30min;待样品走出IPG胶条在凝胶中浓缩成一条线后加到150V,3h;温度:恒温20。八 染色和脱色 考马2h,脱色过夜九 凝胶图像采用GS-800 扫描仪扫描,PDQuest7.4.0 图像分析软件进行分析, 进行蛋白斑点检测, 凝胶匹配, 根据Normalized Volume值的变化来判断蛋白斑点表达量的变化。
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