题目：产绿原酸金银花内生菌的分离研究摘要目的：通过对金银花不同组织器官内生真菌的分离，筛选能产生绿原酸的菌株，通过菌株的筛选及培养条件的优化，获得高产绿原酸的发酵菌株及培养基和培养条件。方法：从金银花不同组织器官中分离内生真菌，通过分离纯化、发酵，对其发酵产物进行TLC和HPLC分析，同时利用显微观察法对其进行显微鉴定，对筛选的高产绿原酸菌株的发酵培养基和培养条件进行优化选择，并对菌株发酵液进行抑菌学实验。结果：从金银花中分离筛选到三株纯化的的内生真菌，其浓缩发酵液与对照品有相同的迁移率，保留时间与对照品保留时间一致，结果表明，三株纯化获得的内生真菌能产生绿原酸，分别属于青霉属、毛霉属、曲霉属。经过发酵条件的优化，确定最佳发酵培养基为PDB培养基，培养条件为28,120r/min，震荡培养72小时。结论：金银花不同器官中具有丰富的内生真菌，并有可能产生与宿主相同的活性成分绿原酸，纯化的产绿原酸菌株的发酵液具有明显的与金银花相同的抑菌效果。关键词：金银花；内生真菌；绿原酸；发酵缩写词表TLC thin layer chromatography 薄层色谱HPLC high performance liquid chromatography 高效液相色谱PDA potato-dextrose-agar medium 马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDB potato-dextrose broth 马铃薯葡萄糖培养基目录1 前言41.1 内生菌与植物的关系41.2 内生菌天然药物新资源及其展望52 问题的提出63 材料与方法73.1试剂73.2 实验方法83.2.1 菌株的筛选83.2.1.1 实验材料的采集83.2.1.2 样品的消毒处理93.2.1.3 表面消毒效果的检测93.2.1.4 分离与纯化93.2.1.5 菌种的保藏103.2.2 菌株次生代谢产物检测103.2.2.1 菌株的小样培养103.2.2.2内生菌发酵液的提取处理103.2.2.3 薄层色谱法(TLC)检测绿原酸113.2.2.4 高效液相色谱法(HPLC)检测绿原酸113.2.3 内生真菌的形态学鉴定113.2.4 二次发酵培养基的优化123.2.4.1 固体基本培养基的选择123.2.4.2 液体基本培养基的选择123.2.4.3 发酵条件的单因素优化133.2.4.4 发酵条件的正交试验133.2.5 金银花内生真菌的抑菌实验144 结果与分析154.1 菌株筛选的结果154.2 菌株次生代谢产物检测结果154.2.1 薄层色谱法(TLC)检测154.2.2 高效液相色谱法(HPLC)检测164.3 内生真菌的形态学鉴定结果194.3.1 传统鉴定方法194.3.1.1 菌株形态学描述194.3.1.2 显微形态鉴定214.4 二次发酵条件的优化结果254.4.1 固体基本培养基的选择结果254.4.2 液体基本培养基的选择254.4.3 纯化分离出的菌株发酵液形态274.4.4 发酵条件的单因素比较294.4.4.1 碳源的选择304.4.4.2 氮源的选择304.4.4.3 温度的选择314.4.5发酵条件的正交试验324.5 抑菌实验结果345 结论与讨论356 展望36参考文献371 前言1.1 内生菌与植物的关系内生菌(endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。内生菌也可理解为植物组织内的正常菌群，它们与植物的关系相当密切，是植物微生态系统的天然组成成分。关于内生菌的起源仍然有不同的观点，存在两种假说，即“内生说”和“外生说”:内生说认为内生菌与宿主植物应该具有相同或相似的遗传背景；外生说认为内生菌源于植物体外，通过植物体表、根际的自然孔口、伤口或诱导植物形成的通道进入体内。内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内生菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境，而内生菌以宿主植物的组织和细胞及其代谢产物为外环境，两者之间互相进行物质、能量及基因交流，在长期进化过程中与宿主协同进化，在演化过程中两者形成了互利共生的关系。一方面内生菌可从宿主中吸取营养供自己生长所需；另一方面，内生菌产生的次生代谢产物，能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对非生物胁迫（如抗干旱）和生物胁迫（如抵抗病虫害等）的抵抗能力，内生菌与宿主植物在长期协同进化过程中彼此构成了和谐稳定的生态关系。另有观点认为内生菌与宿主植物间存在基因交流，对红豆杉，长春花等药用植物内生菌的研究中，通过对其内生菌的发酵液进行化学分析，分离得到了和宿主植物相同或相似的生理活性成分，可见宿主植物与其内生真菌由于长期的共同生活因而关系非常密切。1.2 内生菌天然药物新资源及其展望研究发现某些内生菌可以产生与宿主植物相同或类似的生理活性成分，这一发现可能在一定程度上解决了某些药物资源短缺的问题。近年来先后从红豆杉（Taxus），长春花等药用植物中分离得到了内生真菌，并从这些药用植物内生真菌发酵液中分离得到了和宿主植物研究相同或相似的生理活性成分。内生菌作为许多重要药用成分的新来源，可工业化生产而不受土壤气候以及资源的限制，从而缓解了药物资源的短缺。目前已经从红豆杉、长春花、银杏等植物中分离出能产生活性成分的内生真菌1,2,3。1993年Stiede首次从短叶红豆杉(Taxus breviflia)中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌(Taxomyces andreanae)，此后对东北红豆杉也进行了研究3。云南大学张玲琪等从桃儿七（Sinopodophyllum hexandrum）的茎中分离到能够产生鬼臼毒素的内生真菌4,5,6。从桃儿七植株中共分离得到28株真菌，其中有两株能够产生鬼臼毒素类似物，它们分别属于青霉属和交链孢属。1999年，中山大学王伟等人从南方红豆杉(Tchinensis varmairei)中分离得到87株内生真菌，其中有6个菌株能分泌紫杉烷类化合物，它们分别属于头孢霉属、轮柄梳霉属和无孢菌群等。通过比较发现， 以上产生与宿主相同或相似生理活性成分的内生真菌菌株之间并不存在种属联系，表明内生菌具备这一能力并不是偶然现象。这些发现掀起了一场从药用植物体内分离内生菌的热潮，为人类解决某些药用植物生长缓慢、资源短缺等问题提供了新思路。另一方面，多样性的内生菌也能产生许多具有生物活性的次生产物，从而增强植物的抗逆性，表现在非生物胁迫（如抗干旱）和生物胁迫（如抵抗病虫害等）方面，这些次生代谢产物多数具有抗菌、抗肿瘤等生物活性。本研究通过分离金银花内生真菌得到产绿原酸的菌株，寻找出此类菌株是如何通过其自身次生代谢产物来影响宿主次生代谢产物的产生，探讨两者之间的相关性。并以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌为指示菌，通过纸片法对分离得到的能够产生绿原酸的金银花内生真菌进行抑菌学实验，验证其发酵液中的次生代谢产物具有抑菌活性。本研究为后期利用金银花内生真菌工业发酵生产绿原酸提供科学理论依据，具有很大的经济价值和研究意义。2 问题的提出在河南的道地药材中，近几年有一种药材，价格连年上涨，而且用途广泛，这就是我们关注的-金银花，金银花具有清热解毒、通经活络、广谱抗菌及抗病毒等功效，70%以上的感冒、消炎中成药原料药材中几乎都有金银花的踪迹，具有“中药抗生素”、“绿色抗菌素”之称。金银花的作用除药用外，其饮料、美容、减肥和保健养生的作用更为神奇，对身体所起到的巨大保护和修复作用是十分显著的。金银花既然有如此之多的用途，它起作用的活性成分什么？通过请教老师和查阅资料，得知金银花所含绿原酸是其主要的活性成分之一，绿原酸能促进人体新陈代谢、调节人体功能、提高免疫力。既然清楚绿原酸是金银花的活性成分，绿原酸具有抗菌、消炎、解毒、利胆、降压、升高白细胞及显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌等药理作用。那么绿原酸在植物体内是如何产生的，它和土壤中的大量微生物存在有关系吗？而且在植物体内有一类微生物存活于健康植物组织内部，在长期进化过程中与宿主协同进化，在演化过程中两者形成了互惠共生关系，此类微生物称为内生菌。那么在金银花中有没有能产生绿原酸的内生菌。那如果能把该菌分离出来，就可以利用微生物发酵生产金银花中活性成分绿原酸了。那样就可以节约大量的土地和劳动力，又能实行工厂化生产。那么，采用什么样的技术才能分离出产绿原酸的金银花内生菌并进行培养发酵呢？于是我们开始了从金银花中分离产绿原酸内生菌的研究历程。3 材料与方法3.1试剂可溶性淀粉 天津市化学试剂三厂蛋白胨 上海东海制药厂牛肉膏 北京奥博星生物技术有限责任公司琼脂 北京奥博星生物技术有限责任公司葡萄糖 上海化学试剂采购供应站试剂厂硅胶H 青岛海洋化工厂甲醇 天津市风船化学试剂科技有限公司乙酸丁酯 天津市风船化学试剂有限责任公司羧甲基纤维素钠 天津市福辰化学试剂厂氯仿 淄博广然化工有限公司甲苯 天津市富宇精细化工有限公司甲酸 上海三浦化工有限公司乙腈 天津市四友精细化学品有限公司以上试剂除乙腈，甲醇外均为分析纯。KNO3 ，K2HPO4 ，MgSO4 7H2O ，NaCl ，FeSO47H2O等均为天津市化学试剂三厂培养基配方PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mlPDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，自然pH以上各种培养基配制好分装完成后于121,20min的环境中灭菌。3.2 实验方法3.2.1 菌株的筛选3.2.1.1 实验材料的采集选取健康金银花植株的不同组织部位（新鲜根、茎、叶、花）作为内生真菌分离的实验材料，采摘时，尽量选择植物老的组织部位，因为对老的组织采样能最大程度的发现内生菌的多样性，此外尽量选择对离地面较远的组织采样，减少因泥土溅到组织上造成的表面杂菌污染。采集后立即保存于保鲜袋内，4冰箱保存，24小时内进行内生菌的分离。3.2.1.2 样品的消毒处理金银花组织表面消毒方法的考察。将样品用自来水洗净，无菌剪刀剪成0.50.5cm2的小块，采用75%乙醇与5%次氯酸钠相结合的方法进行表面消毒。表1 金银花内生真菌分离的消毒方法方法Solution处理时间(s)Time treated无菌水（sterilized water）30（2 times)75%乙醇（ethanol）30（1 times)无菌水（sterilized water）30 (3 times)5%次氯酸钠（NaCl0） 60（5 times）无菌水（sterilized water） 60（5 times）3.2.1.3 表面消毒效果的检测 取最后一次消毒的无菌水200L置入已消毒培养基中，紧贴培养基本表面，作为对照组，以确定金银花组织表面消毒彻底。3.2.1.4 分离与纯化 将植物组织用无菌剪刀剪成0.50.5cm2的小块，接种于PDA培养基上，并取最后一次消毒无菌水用无菌棉签涂抹于PDA培养基上，作为对照。将培养基置于28暗室恒温培养5天，定时观察，当有新