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微生物来源的免疫抑制剂的研究现状摘要:微生物来源的免疫抑制剂的研究,最早是1968年Lazary等分离出的 化合物ovalicin。环抱菌素的出现,使器官移植的存活率大大提高,给器官移植 医学带来了革命性的变化。近几年来,不断有新的选择性免疫抑制剂出现,本文 对几种重要的徽生物来源的免疫抑制剂(麦考酚酸,环孢菌素,他克莫司,西罗 莫司,15-deoxysperguali n,吗替麦考酚酯)在作用机制、药理、临床应用和不良 反应方面作一综述。关键词:微生物来源;免疫抑制剂;选择性免疫抑制剂(imm unosuppressant)是一类通过抑制细胞及体液免疫反应而使 组织损伤得以减轻的化学或生物物质,可抑制机体异常的免疫反应,主要应用于 器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、风湿热、胶原病、 红斑狼疮、皮肤真菌病、强直性脊柱炎、膜肾球肾炎、炎性肠病和自身免疫性溶 血性贫血)的治疗1 。目前免疫抑制剂可分为以下几类:中短效的肾上腺皮质激素(cortieosteroid steroids),如泼尼松、甲泼尼松、甲泼松龙;烷化剂(alkylating agent),如环磷酰 胺、苯丁酸氮芥;抗代谢物(antimetabolite),如吗替麦考酚酯(MMF)、甲氨蝶吟、 硫唑嘌呤、巯嘌呤、咪唑立宾 ;核苷酸还原酶或酪氨酸激酶抑制剂 (nucleo -tidyl reductase inhibitor and tyrosinase inhibitor),如羟基脲、青霉胺、来氟米特;具有 免疫抑制作用的植物药(plant glucoside),主要有雷公藤多苷、白芍总苷;钙神经 氨基酶抑制剂(calcineurinphosphaminase inhibitor),如环抱菌素、他克莫司;雷 帕霉素靶分子抑制剂(rapamycin targetmolecular inhibitor),如西罗莫司、胍立莫司; 生物药品和单克隆抗体(monoclonal antibody),如抗胸腺细胞免疫蛋白、莫罗单 抗cd3、达利珠单抗、巴利昔单抗、依法珠单抗、那他珠单抗。目前,国内外免疫抑制剂的研究进展倾向于微生物来源的免疫抑制剂和生物 基因技术类免疫抑制剂,本文主要介绍已在临床使用或处于临床研究的几种微生 物来源的免疫抑制剂。1 、麦考酚酸麦考酚酸(m ycophenolic acid )是Gosio于1896年发现的抗菌物质,为短密青霉 (Penicillium brevicompactum)产生的抗真菌、抗肿瘤和免疫抑制的抗生素。其为 苯呋喃类化合物。麦考酚酸通过抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶阻止鸟嘌呤的合 成,选择性地抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的增生,从而发挥免疫抑制作用。2 、环孢菌素1969-1970年瑞士 Sandoz公司在巴塞尔微生物研究所进行抗真菌药物筛选 时,从美国和娜威的土坡中分离到两种不完全真菌即 Cylnidroarpon lucidum 和 Tolypocladium inflatum后者正式名称为白疆菌(Beauveria bassiana),产生窄谱 有抗真菌活性的环孢菌素。环抱菌素(ciclosporin,环抱菌素A, CsA)是一种中性、高亲脂性的由11个氨 基酸组成的环状结构化合物。环抱菌素A分子式为C62H111N11O12,分子量为1 202。 环抱菌素除了8-位D-丙氨酸是R构型外,所有的氨基酸都是S-构型,而且3-位是 肌氨酸(N-甲基丙氨酸),7个氨基酸是N-甲基化的,1个氨基酸比较特殊(在1-位), 迄今为止在自然界中还没有发现,定(4R)-4-(E)2-丁基卜4, N-二甲基-Z-苏氨酸 (Me-Bmt),也称为C -9氨基酸,分子量为1202。除环抱菌素外,至今已分离出 天然的同系物有30多种,从环抱菌素A到环抱菌素乙除了3-位N-甲基丙氨酸和 8-位D-丙氨酸外,所有的氨基酸序列都可发生变异。与环抱菌素A相比,6-、9- 和10-位缺少N-甲基,是独特的结构修饰,分别为环抱菌素U、R、X和环抱菌素 E、H及W。结构上最大的变化是在2-位,如2-位为L-2-氨基丁酸称环抱菌素A, 为L-丙氨酸称环抱菌素B,为L-苏氨酸称环抱菌素C,为L-绷氨酸称环抱菌素D。Bmt=4-rnathyl - L-ihreoni npcan_臥_阳(S) 97/-N CN一COAT1CHsCHj丿艮CM CHS=h/drtjgen bond23Bore 1于1976年发表了环抱菌素具有强免疫抑制作用的报道,英国Caine在进 行动物实验以后,于1978年初开始用于肾移植,接着又用于肝移植, 1980年实现 了全分子合成。环孢菌素强有力的免疫抑制作用和较少的副作用具有划时代的意 义,1983年被美国食品与药品管理局(FDA)批匕准应用于临床,是第一个具有真正 选择性的免疫抑制剂。它使各种脏器移植的成功率有很大的上升,因此后来环孢 菌素在20世纪80年代成为免疫抑制法的中心话题,开辟了脏器移植的新纪元,进 行肾脏、心脏、肝脏和胰脏移植的病人数目也急速增加,并确定了把心脏移植、 肝脏移植作为临床治疗方法之一的地位。环孢菌素成为新一代免疫抑制剂。作为一种有效的免疫抑制剂,环抱菌素A的主要特点是抑制作用的选择性, 它主要作用于T细胞,抑制其活化,而在药理剂量下对T细胞的产生没有抑制作 用。环抱菌素A抑制T细胞活化的早期,即作用于细胞周期的G0-G期的界面,阻止 细胞进入G期,抑制辅助性T细胞(Th)产生IL-2、IL-3、IFN-y等各种淋巴因子和 IL-2R的表达,或环抱菌素A抑制植物凝集素(PHA)、Ca2+载体A23187等引起细胞 内钙离子增加所诱导的淋巴细胞活化,抑制IL-2、IL-2R等的基因活化和mRNA 的转录,从而抑制了细胞毒T细胞(Tc)的产生。另外,环抱菌素A对B细胞和巨噬 细胞增殖和功能没有直接的抑制作用,这一点对移植耐受性的形成很有意义5。国内环抱菌素A生产基本流程:培育米抱子-进入一级种子罐-进入二级种子罐-进入发酵罐-放罐-过 滤,弃滤液,用酒精浸提-收集浸泡液,过柱浓缩,除杂质-萃取,除杂质,进一 步浓缩f结晶f环抱菌素粗粉f乙酸乙酯溶解,真空减压蒸出乙酯f过硅胶柱层 析f纯的环抱菌素A组(精粉)。对环抱菌素A生产工艺的改进:菌种方面,培育环抱菌素A高产突变株;发酵方面,对原有的斜面、发酵配方以及装量、PH、灭菌时间、培养温度 条件进行优化。另外,发酵过程增加补料工艺,适当延长发酵周期或连续发酵可能 取得较好的效果7。分离纯化方面,有人应用高速逆流色谱法(HSCCC)对环抱菌素的分离纯化 进行研究,选择石油醚:丙酮:水(3 : 3: 2, VDV )为两相体系,计算环抱菌素 A、B、C、D在两相体系中的分配系数,以上相为固定相,下相为流动相进行高 速逆流色谱分离纯化,高效液相色谱法测定单组分纯度。实验结果表明一次高速 逆流色谱即可将环抱菌素粗品分离纯化,得到纯度98.15%以上的环抱菌素A、B、 C、D单组分,收率达85%以上。环抱菌素A的生物合成过程为:一方面通过丙氨酸消旋酶的催化作用,不 断的提供D-丙氨酸作为底物;另一方面在环抱菌素合成酶的作用下,活化底物氨 基酸,并以硫酯的形式结合于酶上;然后在上述两种酶的偶联反应里,从D-丙氨 酸开始,产生了D-SKP(D-环-D-丙氨酸-N-甲基-亮氨酸)。再由此逐个依序加上环 孢菌素的组成氨基酸,延伸并形成线状十一肽,最后在合成酶的作用下迅速环化。在环抱菌素A的生物合成过程中,至少包括如下反应:11个氨基酸的腺苷化 反应;11个转硫醇反应;7个N2甲基化反应;10个肽链的延伸反应和最后的环化 反应。所有的这40步反应的催化反应都是由环孢菌素合成酶完成。环孢菌素合成 酶的一个重要特性是特异性不强,因此,环孢菌素的生物合成强烈的受发酵培养 基中底物氨基酸种类的影响,如DL-氨基丁酸可以提高环抱菌素A的产量而抑制 其它环孢菌素组分的形成。但是,生物合成的方法较为复杂,现在仅处于实验室 研发阶段,并未正式投入生产。环抱菌素A的有机合成过程:strategy used 位h the synihis of He peptidesstep sequence fcr the pcptidc-bcnd rormation23 109 4 8 7 6 5u HUH! 1H-D-AIa-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt-Abu-Sar-MeLeu-VakMeLeU-Ala-OHX 910!;12345 G 7amino acid number in cyclosporineFig, 2* Si.rategy ami Slap Sequence Used far the Synihests of ihe Peptides.23应用:环抱菌素A的免疫抑制作用使其主要用于器官移植时的抗排斥反应和 移植物抗宿主病(GVHD)的治疗。随着对环抱菌素A作用机制的不断认识,以临 床某些疾病的发病机制的不断明确,日前环抱菌素A己不仅应用于抗排斥反应。 近年来,该药在治疗免疫系统有关的疾病方面,特别是自身免疫性疚病方面也得 到了肯定的评价。(1)器官移植在肝脏移植中联合应用环抱菌素A和强的松,多数接受移植者能够存活相长 的时间。环抱素菌A的出现也使心肺联合移植以及胰、骨髓等器官移植等得实现。(2)再生障碍性贫血(AA )异常免疫介导的造血抑制被认为是AA的重要发病机制。40%70%的AA患 者存在免疫异常,T细胞异常,T4/T8比例倒置,T8活性增高,造血负调节因子 增加。研究证明,环抱菌素A是治疗AA的有效药物,有效率约为50%9。( 3)肾病综合征 肾病综合征由多种肾小球疾病引起,其发病均与免疫有关。临床应用环孢菌 素A后多数患者蛋白尿显著减少。环抱菌素A主要通过提高肾小球基底膜的孔径 选择性和电荷选择性,以减少蛋白尿的产生,并可能通过抑制细胞因IL-2的产生, 影响肾小球基底膜的通透性,以减少尿蛋白排除。有报道10用环抱菌素A治疗 难治性肾病综合征,总有效率为92. 3%。(4)类风湿性关节炎(RA )最近对RA的病理研究表明,引起RA关节破坏的因子为类风湿滑膜产生的细 胞因子,如白介素(IL -1,IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)等,也称为前炎症性细胞 因子。CsA有抑制细胞因子合成的作用,见效快,可用于急性、难治性病例11。( 5)银屑病银屑病患者存在免疫功能紊乱,患者血液中T抑制细胞明显下降,T辅助细胞明显升高。环抱菌素A能调节T细胞亚群比例,治疗银屑病症显著改善,总有 效率高,在其它疗法不能控制病情时可应用12。3 他克莫司他克莫司(tacrohimus, FK506)是1984年Kino等从日本北部土壤中分离出的链 霉菌新种橄榄灰链霉菌(StrePtomyces tsukubaensis)FERM BP-927产生的代谢产 物,是23元环的大环内脂。他克莫司的可溶性与环孢菌素相似,易溶于乙醇、氯 仿和丙酮,微溶于水和正己烷。分子式C44H69NO12H2O,分子量为804,为棱柱 状结晶。已完成其化学全合成。他克莫司与环抱素A均为钙神经氨基酶抑制剂,其体外抑制T淋巴细胞的强 度是环抱素A的10 10 0倍,预防各种器官移植所致排斥反应的效果优于环抱素 A13。钙神经氨基酶是一种T细胞活化后调节白细胞介素2(IL-2)基因启动子功能 的丝氨酸-苏氨酸磷酸酶,其被抑制后细胞钙依赖性信号传递也受到抑制,细胞 因子转录所需因子不能被激活。一方面,他
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