TFu对肝门部胆管癌细胞系FRH 目的：探讨N3邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶（N3toluylFlulorouractil TFu）对FRH0201细胞的生物学效应及其作用机制，为胆管癌临床化疗提供参考。方法：光学显微镜、荧光显微镜观察FRH0201细胞在TFu作用后形态学变化；集落形成实验检测TFu对FRH0201细胞的增殖抑制作用；琼脂糖凝胶电泳检测DNA Ladder观察细胞的凋亡；流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡并与5Fu进行比较；MTT试验比较TFu与5Fu等常用化疗药物对FRH0201细胞抑制率。结果：TFu能体外抑制FRH0201细胞的增殖，其作用在0.0164mmol/L范围内具有浓度依赖性及时间依赖性，同浓度比较抑制率高于5Fu；流式细胞仪检测可见随作用时间延长，TFu及5Fu组G1细胞期增多，S期细胞减少，细胞增殖被阻滞在G1期；细胞凋亡检测可见，随作用时间延长，TFu及5Fu组较对照组细胞凋亡率增加，同时相TFu组凋亡率高于5Fu组；化疗敏感性比较，TFu抑制FRH0201细胞增殖作用不及阿霉素和顺铂，但明显优于5Fu及泰素，联合用药：阿霉素、顺铂和TFu联合对FRH0201细胞抑制率最高，达79.02%，优于阿霉素、顺铂、5Fu联合。结论：TFu可明显抑制胆管癌细胞株FRH0201细胞的增殖，该抑制作用可能通过阻滞细胞周期并进一步诱导细胞凋亡机制发生，同摩尔浓度TFu较5Fu对FRH0201细胞抑制作用强，TFu可作为胆管癌联合化疗的新药。胆管肿瘤・N3邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶・氟脲嘧啶・细胞凋亡・细胞周期The effect of TFu on the apoptosis and proliferation of FRH0201 cholangiocarcinoma cell lineObjective:To investigate the effect of TFu on FRH0201 cell and to test new drugs for the chemotherapy of cholangiocarcinoma.Methods:Morphological changes were observed by light microscopy and fluorescence microscopy.The effect of TFu on FRH0201 cell was examined by clone formation.Cell cycle and apoptosis were examined by flowcytometric analysis.DNA ladder was used to detect apoptosis.To compare the drug susceptibility of TFu with 5Fu and several other common drugs by MTT colorimetric assay.Results:TFu significantly inhibited the proliferation and clone formation of FRH0201 cell line within concentration of 0.0164mmol/L.The inhibition ratio was dependent on ascending concentration and time,and that is higher than 5Fu with the same concentration.The morphological character of apoptosis was observed.Flow cytometric analysis indicated that TFu induced a G1 phase arrest and apoptosis more than 5Fu.ADM,DDP and TFu were the sensitive drugs to FRH0201 cel line,and the combination of them can reach the highest inhibition ratio.Conclusion:These results suggests that TFu can more significantly inhibited the proliferation of FRH0201 cell line than 5Fu.The mechanism may be related to the cell cycle arrest in association with apoptosis,which may provide a new approach for treating cholangiocarcinoma.Biliary・TFu・Fluorouracil・Apoptosis・Cell cycle肝门部胆管癌是一种起病隐匿，根治困难，预后很差的消化系统恶性肿瘤，目前认为应采取包括手术、放疗、化疗介入等的综合治疗措施1，其中化疗占非常重要的地位。但胆管癌对常规化疗药物敏感性差，化疗效果不理想，而且存在明显的副作用，因此很多学者都在寻找新的化疗药来提高胆管癌疗效。N3邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶（N3otoluylFlulorouracil,TFu)是在5Fu基础上研制的一种5Fu衍生物类抗癌药，初步研究表明，TFu可明显抑制小鼠S180实体瘤及小鼠肝癌实体肿瘤增殖，尚未对胆管癌进行研究，本实验旨在通过观察TFu对FRH0201肝门部胆管癌细胞生物学效应，并与5Fu等多种化疗药物比较，探讨其作用机制，为胆管癌化疗提供参考。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞株人肝门部胆管癌细胞株FRH0201由山东大学齐鲁医院吴小鹏教授建立2，3。1.1.2试剂TFu由山东大学药学院徐文方教授惠赠。RPMI1640细胞培养基（GIBICO BRL公司产品），胰蛋白酶（Trypsin）(Amresco公司 华美生物制品公司产品)，新生小牛血清（neonatal bovine serum,NBS）(杭州四季青公司产品)。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DSMO）、吉姆萨色素购自Sigma公司。Annexin VFITC/PI双染凋亡试剂盒（深圳晶美试剂公司）。1.2方法1.2.1细胞培养FRH0201细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，在5%CO2培养箱内37、饱合湿度下培养，细胞贴壁生长稳定，23d后细胞接近铺满瓶底，进行细胞传代。1.2.2形态学观察将FRH0201细胞接种于24孔板内，加入含不同浓度TFu的培养液，使其终浓度为8、6、4、2、1、0.25、0.063、0.016mmol/L，并设对照组，每种浓度3个复孔，连续观察。72h后Giemsa染色观察细胞形态。制作细胞飞片，上述浓度TFu作用72h，取出玻片，PBS洗2次，甲醇固定15min，0.01%吖啶橙染色5min，PBS临时封片，荧光显微镜下观察。1.2.3集落形成能力测定常规收集细胞接种于24孔板中，每孔50个细胞，培养24h后细胞贴壁，弃掉培养液，加入TFu浓度为0.0048mmol/L的培养液，并设对照组，每种浓度设3个复孔，培养至肉眼可见细胞克隆时行Giemsa染色，镜下计数50个细胞的克隆数，计算克隆形成率。1.2.4DNA Ladder测定常规收集不同用药组与对照组细胞，PBS洗1次，离心收集细胞，加入白细胞裂解液，酚/氯仿液抽提，提取DNA，70%乙醇洗DNA，真空抽干，溶于TE缓冲液中，常规1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压80V，电泳40min，观察并摄片。1.2.5流式细胞仪检测细胞周期及凋亡分别收集1个TFu、5Fu浓度为0.063mmol/L作用24、48h的细胞，对照组为未加药的同期生长细胞，1000r/min离心5min，PBS洗涤1次，再次离心去上清。各取大约1105个细胞按Annexin VFITC/PI双染凋亡试剂盒说明分别加入Annexin V和PI上机检测；其余细胞用70%预冷乙醇固定，4过夜；离心弃乙醇，3ml PBS重悬；400目筛网过滤，离心去上清；1ml碘化丙锭4避光染色30min；流式细胞仪检测，激发波长为488nm，发射波长为630nm。1.2.6MTT实验将FRH0201细胞接种于5块96孔板中，每孔2103个细胞，培养24h后细胞贴壁，弃掉培养液，实验组加入含0.0164mmol/L TFu的培养液，对照组加入含有相同摩尔浓度5Fu的培养液，阴性对照组只加培养液，继续培养。加药后24、48、72、96、120h向每孔内加入20l MTT，继续培养4h后吸出孔内液体，每孔加入150l DMSO振荡10min，空白孔调零，波长540nm，在DG5031型酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值，并计算抑制率。抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）100%。以时间及浓度为横轴，抑制率为纵轴，绘制抑制率曲线。通过药物抑制浓度计算软件（LOGIT法）1.0计算IC50。1.2.7药物化疗敏感性比较比较TFu及5Fu、阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、丝裂霉素（MMC）、长春新碱（VCR）、依托泊苷（VP16）、泰素（TAXOL）7种临床常用化疗药物，其实验浓度根据临床常用量采用公式计算出的血浆峰浓度（Peak Plasma Concentration,PPC）4，5，联合用药组采用0.5PPC，TFu、5Fu分别与ADM及ADM、DDP联合。将FRH0201细胞以每孔5103接种96孔板，细胞贴壁后加入不同的药物及药物联合继续培养，并设对照组，每组设5个复孔，72h后按1.2.6方法检测每孔OD值并计算每组抑制率。1.3统计学方法流式细胞术结果采用列联表资料的2检验，MTT实验结果采用t检验及方差分析。2结果2.1形态学变化当TFu浓度高于4mmol/L时细胞培养24h后逐渐变圆，不再贴壁，逐渐死亡，台盼兰染色无活细胞。40.016mmol/L组细胞随着药物浓度降低细胞生长密度逐渐升高，细胞逐渐伸展，死亡细胞逐渐减少。