北京理工大学珠海学院胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究摘 要胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究，包括胰蛋白酶亲和配基CHOM的制备，胰蛋白酶的亲和层析分离纯化，凝胶电泳鉴定及分子量测定，胰蛋白酶的动力学研究等。分离纯化蛋白质是研究蛋白质结构、化学组成和生物功能的基础。根据蛋白质的不同性质，分离纯化的方法也是不同的。关键词：分离定量 亲和层析 凝胶电泳 动力学研究目 录 摘要I 1、蛋卵粘蛋白的分离与定量1 1.1蛋白质沉淀法11.2高速离心法11.3蛋白质脱盐11.4蛋白质定量21.5蛋白质标准曲线制作及CHOM浓度测定2 2、亲和层析法分离纯化胰蛋白酶32.1亲和层析法32.1.1亲和层析法的介绍32.1.2亲和层析法的各项要素32.2胰蛋白酶活性测定32.2.1酶活力的测定32.2.2胰蛋白酶活力测定32.2.3N-苯甲酰-L-精氨酸乙脂（BAEE）法42.2.4酪蛋白法43、胰蛋白酶的凝胶电泳鉴定 5 3.1蛋白电泳槽的组装 5 3.2凝胶的选择和制备 53.3样品的处理 63.4电泳 63.5染色与脱色 63.6实验结果及处理 74、胰蛋白酶动力学研究 8 4.1胰蛋白酶的酶促反应的米氏常数 Km 及最大速率 V 的测定 8 4.1.1绘制时间-光吸收关系曲线法8 4.2终止法测定胰蛋白酶的Km、最大速率 V 及胰蛋白酶抑制剂的动力学研究 8 5、总结11 参考文献12谢辞 13 111 蛋卵粘蛋白的分离与定量材料：新鲜鸡蛋，透析袋操作：1.1蛋白质沉淀法在各种分离方法中，沉淀法是常用在前面的几个步骤，尤其很多方便的沉淀方法，可以有效地将蛋白质从粗提液中分离出来。 硫酸铵沉淀法：每个蛋白质溶液分子表面上，都分布有若干比例的非极性区域，会凝集许多水分子以便溶入水溶液中；若在此水溶液加入大量硫酸铵，则因为硫酸铵的高度水合能力，抢走聚集在蛋白质表面的水分子，使得蛋白质表面的非极性区域暴露出来，相互以疏水性引力结合，并成为聚合体而沉淀下来。 等电点沉淀法：若把蛋白质溶液的PH调到其等电点，则此蛋白质所带的净电荷为零，分子间的排斥力因而下降，得以相互吸引成聚合体而沉淀。 溶剂沉淀法：当蛋白质水溶液加入大量有机溶剂，水分子浓度被稀释，蛋白质的溶解度便迅速下降，而沉淀下来。但有机溶剂有丙酮或甲醇，在沉淀后也常用乙醚来带走丙酮，以加速干燥。另外，三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)是很强的蛋白质变形剂，许多蛋白质遇到TCA都会变性沉淀，无法再恢复原态。TCA对皮肤有很强的腐蚀性，不小心接触后要马上冲水，通常TCA并不被用在纯化蛋白质的步骤中，而是用来沉淀或移除大部分非目的蛋白质。1.2高速离心法离心是分离固态与液体最方便的方法，因此蛋白质以上述方法沉淀下来后，接着便可用高速离心法，把形成固态或半固态的带白纸分离出来。这样的离心都要在低温下进行，以免离心时产生高温，导致目的蛋白变性。在实验室中，高速离心机是较危险的仪器，一定要注意离心管是否正确平衡，离心转速是否设定正确。第一次操作任何离心机时，一定要有熟练的人员在旁监督，以免发生危险。1.3蛋白质脱盐脱盐是一种重要的生化操作，可以把小分子与巨分子分离开来，是生化实验常用的步骤，通常脱盐效果的好坏，对下一步实验有决定性的影响。有下面几种方法可以使用：析袋：是最常用的方法，透析袋有各种大小不同的网目，可以分离分子量不同的大小分子。透析袋一般在使用前需经前处理。体过滤法：可以依照分子量大小不同来进行分离，利用胶体小球内的孔道，使小分子进入而被延滞在胶球内，大分子则得以迅速流出，因而出了盐类，达到脱盐的效果。微薄膜过滤：超微薄膜是一层具有极小孔径的薄膜，可以区别分子的大小，小分子如盐类可以通过微孔，大分子则被保留，因而去除盐类；通常使用超微薄膜过滤都需要加压，以增加小分子通过的速率。1.4蛋白质定量蛋白质定量是最基本的生化操作，方法很多，但其原理都还是基于蛋白质分子的基本构造。早先使用Biuret method，是根据蛋白质骨架与铜离子结合，利用所产生的还原力显色；而Lowry method是以Biure method为基础，再加上蛋白质中Try侧基的显色，使得分析更为灵敏。最近则使用燃料Coomassie Brilliant G-250(CBG);当蛋白质与CBG结合之后，CBG由茶色变成蓝色，显色浓淡与蛋白质质量成正比，称为Bradford method。以Bradford法定量蛋白质Bradford dye-biding method是利用Coomassic Brilliant Blue G-250(CBG)可与蛋白质结合而变色的特性来定量；若样品中蛋白质质量较多，则结合到蛋白质而表色的CBG也多，因而显色较深。本实验就是以一组标准蛋白质为对象，制作一条蛋白质与光吸收值的标准曲线，然后求得所测样品的蛋白质含量。1.5蛋白质标准曲线制作及CHOM浓度测定图1 蛋白质含量标准曲线表1 CHOM样品浓度测定表CHOM样品溶液0.15M Nacl考马斯亮蓝试剂A595测得样品溶液浓度0.001L0.299L3.00L0.48725mg/mL2 胰蛋白酶的亲和层析分离材料：鸡卵类粘蛋白，CHOM溶液，猪胰脏操作：2.1亲和层析法2.1.1亲和层析法的介绍若A与B两分子之间，有专一性的亲和力，而我们手中已有A；若欲从样品混合物中，将所含的B分子分离出来，则最简便的方法，是先将A固定在一固定相（solid phase）上，当样品混合物通过此固定相时，其中的B分子即被A吸附到固定相。在洗去混合物中其他杂质后，破坏A-B之间的吸引力，溶离下B，即可得到纯质B。亲和层析法是很有效的纯化方法，但并非任何物质均可应用此法，因为不一定能找到对它有亲和力的分子。因此，进行亲和层析法的第一条件为，寻找分子之间具有亲和力的配对：A+B=AB而其理解常数，Kd=AB/AB约在10-4至10-8；亲和力大小须适中。可以用图X4-1说明亲和层析法的进行步骤：1) 分子A已经被结合到固相载体上（斜线部分），样品准备从上方流下，其中含有所要分离的B分子以及非专一性分子杂质。2) 当样品通过此亲和吸附剂时，只有B被吸附，其余杂质将直接流出。3) 破坏AB分子间的亲和力，即可获得纯质B。2.1.2亲和层析法的各项要素要成功建立一个良好的亲和层析法，必须考虑几个重要因素1） Ligand及其专一性结合分子2） 良好的固相载体3） Ligand与固相载体的偶联反应4） 可溶离下所要分离的目标分子2.2胰蛋白酶活性测定2.2.1酶活力的测定在酶的分离纯化过程中，都要随时测定酶活性，计算酶的比活性，用以确定分离过程中各步骤的效能、决定粗酶的取舍以及酶储存期间质量的变化，所以酶活性的测定是酶学研究中最常用的实验方法。2.2.2胰蛋白酶活力测定在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N-端得赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。2.2.3N-苯甲酰-L-精氨酸乙脂（BAEE）法2.2.4酪蛋白法胰蛋白酶活力和比活力的测定表三 酶活力测定加样表（单位 mL）试管0.05M,PH,8.00.001M Hcl酶液BAEE底物样品稀释倍数空白2.00.2-0.81测定2.18-0.020.8图二 亲和层析洗脱曲线图三 时间-光吸收关系曲线胰蛋白酶溶液的活力单位(BAEE单位/mL)= =11050胰蛋白酶比活力(BAEE单位/mL)= =2031253 胰蛋白酶的凝胶电泳鉴定材料：CHOM，胰脏提取液（PX，粗酶），trypsin.操作：3.1 蛋白电泳槽的组装 将垂直平板电泳槽装好实验前后，必需使用干净纱布和少量洗手液清洗玻璃板，然后用清水冲洗干净，洗干净的玻璃板从水盘中轻轻拉出，应不挂水滴，否则请重洗。 制胶底座橡胶的保护膜请勿丢失，实验结束后应将保护膜重新盖好橡胶。 主体与制胶底座装配完毕后，应用水先试漏；试漏后可用滤纸将水吸干或倒出。 主体与制胶底座装配完毕后，如需移动时，应将力作用在制胶底座，在桌面水平推移，禁止直接提起主体，以防漏液。3.2 凝胶的选择和制备 a) 按照蛋白质不同的相对分子量选用不同浓度的分离胶，b) 分离胶的灌制 根据待测蛋白质样品的相对分子量选择合适的分离胶浓度，本实验胰蛋白酶的分子量约为23,400，采用 12%的分离胶，配制 10 mL。 在 50 mL 烧杯中根据配方表按顺序依次加入试剂，由于加入过硫酸铵（AP）后凝胶就开始聚合，所以应立即摇晃烧杯小心混合均匀，并避免气泡产生，然后用注射器吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加 1 cm的空间以便灌注浓缩胶，用注射器小心地在溶液上覆盖一层纯水，以压平凝胶液面。将电泳槽垂直静置于室温下约2030 min，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的纯水，尽可能去干净。灌胶高度示意图c) 浓缩胶的配制和灌制 一般采用 5%的浓缩胶，在 50 mL 烧杯中根据配方表配制 5 mL，按顺序依次加入试剂，由于加入过硫酸铵（AP）后凝胶就开始聚合，所以应立即摇晃烧杯小心混合均匀，并避免气泡产生，然后用注射器灌注在分离胶上，操作参考分离胶的灌注。直至液面离玻璃板顶端约0.2 cm，小心插入梳齿，避免混入气泡，置于室温下至浓缩胶完全聚合（约 20 min）。3.3 样品的处理a) 标准蛋白样品的制备Protein Molecular Weight Marker (Low)：取出一管预先分装好的 8 L 低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热 3-5 min，取出冷至室温。b) 待测样品的制备：3.4 电泳 a) 待浓缩胶完全聚合后，将主体从制胶底座卸下，放入电泳槽下槽，往内槽加缓冲液至玻璃凹口以上，外槽缓冲液加至距平玻璃上沿 5 mm 处（注意避免在胶室下端出现气泡）；小心拔出梳齿。然后用注射器吸取电泳缓冲液吹洗加样孔（梳孔）数次以赶跑加样孔中的气泡； b) 用移液器将样品依次往凝胶梳孔内加样； c) 加样完成后，盖上上盖，接上电泳仪样品由负极（黑色）向正极（红色）泳动。打开电泳仪电源开关，在电压为 100150 V（8 V/cm），进行电泳，开始电流恒定在 10 mA，当进入分离胶后改为 2025 mA（15 V/cm），溴酚蓝距凝胶边缘约 0.5 cm 时，停止电泳。3.5 染色与脱色 a) 电泳结束后，小心撬