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1. 提取目的基因:既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。2. 提取质粒:使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA.3. 基因重组:取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒”缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。4. 将质粒送回大肠杆菌:再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基 因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收.5. 胰岛素的产生:再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆 菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!学习要求知道DNA的粗提取与鉴定的原理;掌握并能分析DNA粗提取的技术 方法和要求;学会DNA分子的鉴定方法【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题,并初 步巩固.【活动1】阅读教材?54 “基础知识”,讨论并回答下列问题:1. (记忆)提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。2. (记忆)DNA的溶解性特点:DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。【思考1】据图5 1分析:DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点?在014mol/L时溶解度最小;要使DNA溶解,需要使用什么浓度?较高浓度,可使DNA溶解;要使DNA析出,又需要使用什么浓度? 014mol/L可使DNA析出.【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理,可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目 的.3. (记忆)DNA的耐受性特点:蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA;在6080,C时蛋白质变性沉淀而DNA分 子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。4. (记忆)DNA的鉴定原理当鉴定提取出的物质是否是DNA时,需要使用二苯胺(甲基绿)进行鉴定.在 沸水浴条件下,该试剂与DNA反应,呈现(浅)蓝色。二、实验设计【活动2】阅读教材?55 “实验设计”,讨论并回答下列问题:1. (记忆)实验材料的选取:选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提 取的原则。【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA.2. (记忆)破碎细胞,获取含DNA的滤液:鸡血:向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌,用纱布过滤后,收集滤 液。洋葱:向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐,搅拌研磨,用纱布过滤后,收集滤 液。【思考4】在以上实验中,蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂,洗涤剂的 作用是瓦解细胞膜,食盐的作用是溶解DNA物质。3. (学会)去除滤液中的杂质:方案一 :30mL滤液一加NaCl使DNA溶解一过滤得滤液一加蒸馏水使DNA析出 f过滤得过滤物f放到2mol/LNaCl溶液中溶解一DNA NaCl溶解液方案二:30mL滤液一加嫩肉粉(木瓜蛋白酶)一静置10分钟一得DNA滤液方案三:30mL滤液一6067C处理一过滤得DNA滤液【思考5】以上三个方案的原理分别是什么?方案一原理:DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二原理:蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;方案三原理:DNA耐高温而蛋白质不耐高温。【思考6】方案一中:“加NaCl使DNA溶解一过滤得滤液”的目的是除去不溶 (可溶、不溶)于NaCl溶液中的细胞杂质;“加蒸馏水使DNA析出一过滤得过滤物”的目的是除去可密(可溶、不溶)于NaCl溶液中的细胞杂质.4. (记忆)DNA的析出:DNA滤液与等体积冷却酒精混合,静置一段时间后析出的白色丝状物就是DNA。5. (记忆)DNA的鉴定:取2支洁净的试管,编号甲、乙,各加入等量的2mol/LNaCl溶液.甲中放入 少量白色丝状物,使之溶解。在甲、乙试管中各加4mL二苯胺,混合均匀。沸水 浴5min,观察颜色变化,甲试管呈现蓝色。三、操作提示【活动3】(记忆)阅读教材?56“操作提示和P57“课题延伸”,关注下列注 意事项:1. 在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固;鸡血静置或离心后除去血浆,以提高细胞 悬液浓度.2. 实验中使用塑料烧杯和尼龙布,以免DNA被吸附.3. 玻棒沿同一方向缓慢搅拌(细胞破裂时快速搅拌),玻棒不要碰到烧杯壁.4. 二苯胺试剂要现用现配.5. 为提高DNA纯度,实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、SDS等.【活动4】观看视频:观看“DNA的粗提取与鉴定”视频,体会并学会相关技术 方法。课后学习1. 尝试从植物组织中提取DNA分子.2. 基础训练册:将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题.学习要求尝试PCR技术的基本操作,体验PCR技术的分子生物学实验方法;理解PCR技术的 原理;讨论PCR技术的应用【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题,并 初步巩固。一、基础知识【活动1】阅读教材?58 “PCR原理”,讨论并回答下列问题:1. (记忆)PCR技术扩增DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似。【思考1】填写下表:(记忆)细胞内DNA复制条件分析条件参与的组分在DNA分子复制中的作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶打开DNA双螺旋RNA聚合酶合成RNA引物DNA聚合酶催化合成DNA子链;切除引物DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来能量ATP为解螺旋和合成子链提供能量引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3端起点2. (理解)细胞内DNA的复制(1) DNA的结构:脱氧核苷酸分子通过3, 5 一磷酸二酯键连接形成核苷酸长链, 两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化,形成DNA双螺旋结构。DNA的复制:首先,在解旋酶的作用下,由ATP供能,DNA发生解旋形成两 条DNA单链。其次,在DNA单链的匕端,在RNA聚合酶在作用下,合成RNA引物。再次,在DNA聚合酶的作用下,从引物的3端开始合成DNA子链.最 后,DNA聚合酶将引物切去,并合成空缺处DNA单链,再由DNA连接酶将不 连续的DNA子链连接起来。3. (记忆)DNA分子复制的人工控制解开螺旋:在80100C时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性.恢复螺旋:在5060C左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性.复制条件:缓冲液,DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引 物。控制仪器:PCR仪(温度周期性自动调节仪)。【思考2】缓冲液相当细胞内的什么成分?核液。【活动2】阅读教材?59 “PCR的反应过程,讨论并回答下列问题:1. (记忆)填写PCR反应流程:2. (理解)PCR反应过程是:在升温至90C以上时DNA解旋;在降温至50C左 右时引物与DNA单链结合;在升温至72C左右时合成DNA子链。二、实验操作 【活动3】阅读教材?62“实验操作”,讨论并回答下列问题:1. (记忆)在PCR反应体系的配方中,含有的成分有缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物、水。2. (了解)实验操作步骤:按照PCR反应体系配方配制反应液;将PCR反应体系50UL用微量移液器转移到微量离心管(0.5mL)中;将微量离心管放到PCR 仪中;设置PCR仪的工作参数;DNA在PCR仪中大量扩增。3. (了解)水浴法:将微型离心管依次在95C、55C、72C恒温水浴锅中循环 处理。三、操作提示【活动4】阅读教材?62“操作提示”,讨论并回答下列问题:1. (记忆)避免外源DNA污染,所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌.2. (记忆)将缓冲液和酶分装成小份,20C低温保存.3. (记忆)每添加一种反应成分,更换一个移液器枪头.4. (记忆)混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。四、结果分析与评价【活动4】阅读教材?63“结果分析与评价”,讨论并回答下列问题:1. (记忆)反应液稀释:取2? LPCR反应液,添加98?L蒸馏水.2. (记忆)分光光度计调零:将100?L蒸馏水添加到比色杯中,在260nm处将分光光度计读数调节为零。3. (记忆)将100? L反应稀释液倒入比色杯中,测定在260nm处的光吸收值.4. (记忆)DNA含量计算:DNA含量(? g) =50X光吸收值X稀释倍数.【活动4】观看视频:观看“多聚酶链式反应扩增DNA片段视频,学会相关技术 方法.课后学习1. 尝试从植物组织中提取DNA分子。2. 基础训练册:将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题。
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