DB/T 2003浙江省质量技术监督局 发布2003-11-08实施2003-10-23发布动物毛发中盐酸克伦特罗残留的检测方法The analysis of clenbuterol hydrochloride in animal hairDB33/T 4552003DB33浙江省地方标准ICS 71.040G 04备案号：14770-20041DB33/T 4552003前 言本标准由嘉兴市卫生监督所提出并归口。本标准由嘉兴市卫生监督所、浙江省疾病预防控制中心、浙江省畜产品质量安全检测中心、嘉兴市疾病预防控制中心负责起草。本标准主要起草人：吴小龙、吴平谷、宣士荣、葛志坚、邹忠明、 汪刚、王明龙、吴新民。I动物毛发中盐酸克伦特罗残留的检测方法1 范围 本标准规定了以酶联免疫吸附（ELISA）法和气相色谱-质谱联用（GC/MS）法测定动物毛发中盐酸克伦特罗的方法，规定气相色谱-质谱联用法为仲裁法。 本方法适用于动物毛发中盐酸克伦特罗残留量的测定与仲裁。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。DB33/T 307-2001 可食性动物组织中盐酸克伦特罗残留量的检测方法DB33/T 308-2001 饲料中盐酸克伦特罗含量的检测方法DB33/T 309-2001 动物尿液中盐酸克伦特罗残留量的检测方法3 酶联免疫吸附法3.1 原理利用固相酶联免疫吸附原理，将盐酸克伦特罗特异性抗体(羊抗兔IgG )包被于聚苯乙烯微量反应板中，加入毛发提取液、盐酸克伦特罗标准品、酶标记物、盐酸克伦特罗抗体于微孔中，使毛发提取液（未知抗原）和酶标记物中的盐酸克伦特罗抗原（已知抗原）与抗体进行免疫竞争反应，未反应的酶记标物在洗涤中被清除，结合了的酶可以由显色物显示出来。用目测法或酶标法来判断。显色的强弱与样品中的盐酸克伦特罗浓度成反比。3.2 试剂和材料以下所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为重蒸水。3.2.1 盐酸克伦特罗固相酶联免疫试剂盒（德国 r-Biopharm公司或类似产品）。3.2.1.1 预包被微孔条。 3.2.1.2 标准品（6瓶300L/瓶，浓度分别为0ppt、100ppt、300ppt、900ppt、2700ppt、8100ppt ）。3.2.1.3 盐酸克伦特罗酶标记物。3.2.1.4 盐酸克伦特罗抗体。3.2.1.5 基质液。3.2.1.6 终止液。 3.2.1.7 缓冲液。3.2.2 1%吐温-80、体积分数为3%乙醇/乙酸乙酯、体积分数为5%乙醇/乙酸乙酯、乙酸乙酯、50%盐酸、1mol/L氢氧化钠、饱和氯化钠、体积分数为50%乙醇/乙酸乙酯。3.2.3 盐酸克伦特罗SLH净化柱（1000mg/5mL，SLH小柱为商品名，给出这一信息是为了给本行业标准的使用者提供方便，而不是标准主管部门对这一产品的认可）或同等效果的净化柱。3.3 设备与器材3.3.1 酶标仪。3.3.2 洗板机。3.3.3 离心机（3000 r/min -4000r/min）。3.3.4 超声清洗仪。3.3.5 振荡器。3.3.6 水浴锅。3.3.7 旋转蒸发仪。3.4 样品处理3.4.1 清洗：取毛发加1%吐温-80溶液在超声清洗仪中洗涤20min，然后用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发在50干燥2h，放在干燥器中待测。3.4.2 水解：将毛发剪碎混合均匀，准确称取0.1，加入mol/L氢氧化钠溶液mL，在80水浴中保温h后冷却。3.4.3 萃取：在水解液中加mL饱和氯化钠溶液，用50盐酸调节至10左右，加mL乙酸乙酯振荡，离心分出乙酸乙酯相，乙酸乙酯相用氮气吹干。3.4.4 净化：加2L体积分数为3%乙醇/乙酸乙酯溶液溶解剩余物，移到预先用体积分数为3乙醇/乙酸乙酯溶液淋洗的盐酸克伦特罗SLH净化柱上，然后用mL体积分数为5%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脱除杂，最后用10mL体积分数为50%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脱，收集该洗脱液，用氮气吹干。用水4mL溶解剩余物，待测。3.5 测定（或参考类似产品说明书）将试剂盒各组分取出，平衡至室温(20-25)。3.5.1 以1：11的比例吸取盐酸克伦特罗抗体加入到缓冲液中，待用。3.5.2 以1：11的比例吸取盐酸克伦特罗酶标记物加入到缓冲液中，待用。3.5.3 每孔加入已稀释盐酸克伦特罗抗体100L，15min后洗板。3.5.4 分别加入标准品、待测样品(标准品和样品做两孔平行试验)各20L。3.5.5 每孔加入已稀释盐酸克伦特罗酶标记物 100L，30min后洗板。3.5.6 加入100L基质液避光显色15min，加入终止液100L。3.5.7 酶标仪450nm测定。3.6 结果计算3.6.1 计算每个标准品和样品平均吸光度值。3.6.2 每个标准品和样品平均吸光度值除以0ppt的吸光度值再乘以100。以标准品的百分比形式的吸光度值为纵座标，以标准品的浓度为横座标，绘成一个半对数座标系统曲线图，相对应每一个样品的相对浓度（g/Kg）可以以样品平均吸光度值从曲线上查出，乘以样品稀释倍数，即为其实际浓度。3.7 检测限本方法的检测限: 8.0g/Kg 。4 气相色谱-质谱联用法（仲裁法） 4.1 原理毛发样品经过碱水解，然后用乙酸乙酯提取；提取液浓缩后经SLH柱净化，净化洗脱液经过双三甲基甲硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）+1%（）三甲基氯硅烷（TMCS）衍生，然后用GC/MS法测定。4.2 试剂和材料以下所用的试剂和水，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为重蒸水。4.2.1 盐酸克伦特罗标准品。4.2.2 1%吐温-80、体积分数为3%乙醇/乙酸乙酯、体积分数为5%乙醇/乙酸乙酯、50%盐酸、1mol/L氢氧化钠、饱和氯化钠、体积分数为50%乙醇/乙酸乙酯、乙醇、甲醇、甲苯、乙酸乙酯、盐酸、氢氧化钠、浓氨水、无水硫酸钠。4.2.3 BSTFA+1%（）TMCS。4.2.4 SLH净化柱（1000mg/5mL）或同等效果的净化柱。4.2.5 美托洛尔（metoprolol）内标：使用时用甲醇配成10g/mL溶液。4.2.6 4% （）氨化甲醇：取4mL浓氨水，用甲醇定容至100mL。4.2.7 克伦特罗标准储备溶液（100mg/L）：称取11.3mg 盐酸克伦特罗标准品于100mL容量瓶中，用4%氨化甲醇溶解并定容至刻度，存放于4冰箱中备用。4.3 设备与器材4.3.1 气相色谱-质谱联用仪。4.3.2 旋转蒸发仪。4.3.3 超声清洗仪。4.4 实验条件 4.4.1 色谱条件色谱柱：HP5MS5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30m0.25 mm0.25m)；进样口温度300，柱温程序：初温120，保持3min，然后以10min升至230，保持10min，再以20min升至270保持10min。载气为高纯氦气（99.999%），流速0.9mL/min，不分流进样。4.4.2 质谱条件EI源，源温230；电子能量70eV；接口温度280；电子倍增器电压1388V；质量扫描范围35 U350U；选择离子监测方式（SIM）；盐酸克伦特罗监测离子（m/z ）：86、243、262、333美托洛尔监测离子（m/z ）：72。溶剂延迟：5min。 4.5 样品处理 4.5.1 取毛发加1%吐温-80溶液在超声清洗仪中洗涤20min，然后用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发在50干燥2小时，放在干燥器中待测。将毛发剪碎混合均匀，准确称取0.2 g -1.0g，加入 1mol/L氢氧化钠溶液2mL，在80水浴中保温1h后冷却。在水解液中加1mL饱和氯化钠溶液，用50%盐酸调节PH至10左右，然后加5mL乙酸乙酯振荡，离心分出乙酸乙酯相，乙酸乙酯相过无水硫酸钠，用氮气吹干。加2mL体积分数为3%乙醇/乙酸乙酯溶液溶解剩余物，移到预先用体积分数为3%乙醇/乙酸乙酯溶液淋洗的SLH净化柱上，然后用 5mL体积分数为5% 乙醇/乙酸乙酯溶液洗脱除杂，最后用10mL体积分数为50%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脱，收集该洗脱液，加美托洛尔内标20L，用氮气吹干。 4.5.2 蒸发剩余物加 0.1 mL BSTFA+1%（）TMCS，加盖于旋涡混合器上震荡，在80烘箱中加热1h，然后用氮气吹干，加0.1mL 甲苯溶解。同时取20L0.5g/mL克伦特罗标准工作液，加美托洛尔内标20L，吹干后同时进行衍生化。取1.0L甲苯溶液进行GC/MS分析。4.6 测定定性采用保留时间、标准盐酸克伦特罗棒图对照进行NIST98图库检索。以86作为定量离子，262、333、243作为辅助离子进行定性、定量分析。4.7 结果计算定量方法：采用单点或多点校准法定量 ；盐酸克伦特罗（以克伦特罗计）X=mLD/m 式中：X 样品中盐酸克伦特罗含量ng/g或ng/mL；mL质谱测定对应的盐酸克伦特罗含量 ng/g 或 ng/mL ；m 取样量g或mL ；D 稀释倍数 。4.8 检测限本方法的检测限: 8.0g/Kg。_3