实验三蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验内容对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等颜色及沉淀反应进行定性确定。三、实验操作（一）双缩脲反应1、实验原理当尿素加热到180C左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。2、试剂（1）尿素（2）10%NaOH溶液（3）1%CuSO4溶液（4）蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释1020倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。3、操作（1）取少许结晶尿素放在干燥试管，微火加热，则尿素开始熔化，并形成双缩脲，释放的氨可用湿润的红色石蕊试纸鉴定。待熔融的尿素开始硬化，试管内有白色固体出现，停止加热，让试管缓慢冷却。然后加10%NaOH溶液1ml和1%CuSO423滴，混匀后观察颜色的变化。（2）另取一试管，加蛋白质溶液1ml、10%NaOH溶液2ml及1%CuSO423滴，振荡后将出现的紫红色与双缩脲反应所产生的颜色相对比。（二）茚三酮反应1、实验原理除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮作用生成黄色物质外，所有a-氨基酸与茚三酮发生反应生成紫红色物质，最终形成蓝紫色化合物。1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。反应的适宜pH为57。此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。2、试剂蛋白质溶液（同前）；0.5%甘氨酸；0.5%茚三酮水溶液3、操作取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴加热23分钟，观察颜色变化。（三）蛋白黄色反应1、实验原理蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这类蛋白质可被浓硝酸硝化生成黄色的硝基苯的衍生物。该物质在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中转变为橙黄色的硝醌酸钠。绝大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应。皮肤、毛发、指甲等遇浓HNO3变黄即发生此类黄色反应结果。2、试剂（1）蛋白质溶液（同前）；（2）头发；（3）指甲屑；（4）0.5%苯酚溶液；（5）0.3%酪氨酸溶液；（6）10%NaOH溶液；（7）浓硝酸（p=1.42克/毫升）3、操作取5支试管编号后分别按下表-1所示加入试剂，观察各管出现的现象，若有反应慢者可放置微火（或水浴中）加热，待各管均先后出现黄色后，于室温逐滴加入10%NaOH溶液直至碱性，观察颜色变化。表1试验编号管号12345材料加入蛋白质溶液（4滴）指甲屑（少许）头发（少许）苯酚（4滴）酪氨酸（4滴）浓硝酸2滴2ml2ml4滴2滴现象注意：向蛋白质溶液中加浓硝酸时，所出现的白色沉淀是强酸使蛋白质发生变性所致。（四）乙醛酸反应1、实验原理含有吲哚基的色氨酸在浓硫酸存在下与乙醛酸（CHOCOOH）缩合，形成与靛蓝相似的物质。此反应机理尚不清楚，可能是由一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合而成的。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。2、试剂（1）蛋白质溶液（同前）。（2）0.03%色氨酸溶液。（3）冰醋酸（一般含有乙醛酸杂质，故可用冰醋酸代替乙醛酸）。（4）浓硫酸（分析纯）。3、操作：取2支试管，分别加入蛋白质溶液及色氨酸各2滴，再加浓冰醋酸约12毫升，混匀，倾斜试管慢慢地沿管各加浓硫酸1毫升，使之两相重叠，静置5分钟后则两相界面处出现紫红色环，若效果不明显可在水浴加热。（五）偶氮反应1、实验原理偶氮化合物与酚核或咪唑环结合产生有色物质，酪氨酸和组氨酸与之反应则应产物分别为橙红色和樱红色。含有酪氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。应当指出，组胺、酪胺、肾上腺素和胆色素分子也能发生此反应而显色。2、试剂：蛋白质溶液（同前）；（2）0.3%组氨酸溶液；（3）0.3%酪氨酸溶液；（4）20%NaOH溶液；（5）重氮试剂溶液A：5克亚硝酸钠溶于1000毫升水中。溶液B：溶解5克a-氨基苯磺酸于1000毫升水中，溶解后再加入5毫升浓硫酸。A、B液分别存在密闭瓶中，用时以等体积混合。3、操作：取3支试管分别加入0.3%组氨酸、酪氨酸、蛋白质溶液，各45滴，再分别加重氮试剂A、B各10滴，振摇，混匀，取后向3支试管分别加入20%NaOH溶液23滴，观察各试管中有色物质的生成，若水浴加热效果更明显。(六) 、醋酸铅反应1、实验原理多数蛋白质分子中常有含硫的氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱作用下可分解产生硫化钠。硫化钠与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀，若加入浓盐酸则有硫化氢气体产生。2、试剂(1)未稀释的鸡蛋清。(2)10%的NaOH溶液1.5%Pb(Ac)2溶液(醋酸铅溶液)(4) 浓盐酸(5) 醋酸铅试纸(将滤纸条浸入醋酸铅溶液中，湿透后取出，100C烘干即可)3、操作：向试管中先加入1.5%Pb(Ac)2溶液约1毫升，再慢慢滴加10%的NaOH溶液，边加边振摇,直到产生的沉淀溶解为止。此时再向试管内加蛋白质溶液56滴，混匀。置酒精灯上加热1分钟，溶液变黑，小心加入浓盐酸约2毫升，黑色褪去，嗅其味，将湿润醋酸铅试纸置于管口，观察其颜色的变化。实验四蛋白质的沉淀反应一、目的1熟悉蛋白质的沉淀反应。2进一步掌握蛋白质的有关性质。二、原理多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。三、实验器材1试管1.5cmx15cm(x7)。.吸管5.0ml(x2)、2.0ml(x2)、1.0ml(x1)。3吸滤瓶500ml(x1)。4布氏漏斗。四、实验试剂1蛋白质试液：见实验二十三卵清蛋白液。.硫酸铵晶体：如果晶体太大，最好研碎。3饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml加硫酸铵至饱和。495%乙醇。5结晶氯化钠。6 1%醋酸铅：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。7 5%鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至100ml。8 1%硫酸铜溶液：见实验二十三。9 饱和苦味酸溶液。.1%醋酸溶液：冰醋酸lml用蒸馏水稀释至100ml。五、操作A、蛋白质盐析作用向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。操作方法：1取蛋白质溶液5ml,加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。2.将上述混合液过滤,滤液中加硫酸铵粉末,至不再溶解,析出的即为清蛋白。再加水稀释,观察沉淀是否溶解。（）应该先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液。（）固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。B、乙醇沉淀蛋白质乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体的水化层而使其沉淀析出。操作方法取蛋白质溶液lml,加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。C、重金属盐析沉淀蛋白质蛋白质与重金属离子（如Cu2+、Ag+、Hg2+等）结合成不溶性盐类而沉淀。操作方法取试管2支各加蛋白质溶液2ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。D、生物碱试剂沉淀蛋白质植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱，。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。操作方法取试管2支各加2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液45滴，向一管中加5%鞣酸溶液数滴，另一管内加苦味酸溶液数滴，观察结果。