酪氨酸硝基化导致细胞功能损伤的病理生理机制及防治措施东南大学附属中大医院麻醉科 吴琼 景亮 南京 210009在全身炎症反应和感染性休克等病理条件下，炎性介质在激活NOS产生过量NO的同时还通过其他细胞途径增加O2-的产生。由于NO 与O2-反应的速度是正常状态下超氧化物歧化酶与O2-反应速度的3倍，使得NO首先捕捉O2-以极快的反应速度生成多种活性氧(O2-、HO-、H2O2、 ONOO-等)和活性氮（NO-、NO2-、N2O3等），这些产物除了造成氧化损伤外，还可与蛋白质酪氨酸残基或游离酪氨酸发生硝化反应，生成稳定的代谢产物3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）。由于正常人体血浆酪氨酸浓度大约为100 mmol/L，这就为体内酪氨酸的硝基化提供了可能性。酪氨酸硝基化后使体内多种有重要功能的酶/蛋白功能受损或活性下降，损伤线粒体、DNA，抑制酪氨酸磷酸化，诱导细胞的凋亡和死亡。本文就酪氨酸硝基化的产生原因、对组织细胞功能的损伤及防治措施作一简略介绍。 一、酪氨酸硝基化的产生来源正常生理条件下，组织细胞中活性氧（ROS）/活性氮（RNS）的生成与清除的平衡取决各种抗氧化物质和酶的浓度。但多种病理状态下这种生物平衡被打破，体内RNS/ROS生成增加,抗氧化物质活性下降。RNS/ROS的大量产生可以直接损伤蛋白质、核酸和脂质等生物大分子，而ROS与RNS相互反应可以产生更强的毒性效应，即酪氨酸的硝基化。一般认为导致酪氨酸硝基化有如下几个来源：1、过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，ONOO-) 依赖的途径：O2-与NO在体内迅速反应形成ONOO-，ONOO-及其质子化形成的共轭酸ONOOH具 有很强的氧化和硝基化作用，可以通过金属离子或金属蛋白（如Cu/Zn-SOD）的催化作用下与Fe3+活性中心反应形成中间产物（oxo-Fe4+）和NO2，NO2与酪氨酸的芳香环结合生成3-NT或者与酪氨酸直接反应，第一步生成酪氨酰自由基（TYR.）和NO2，NO2与TYR.基团结合形成终产物3-NT。体外实验也证实，ONOO-确实可以使组织蛋白质发生硝基化反应，经ONOO-处理的细胞中，硝基化蛋白质的含量明显增高。2、非ONOO-依赖的途径，其中包括：过氧化物酶（Heme Peroxidase）依赖途径：在体内，过氧化物酶(包括髓过氧化物酶，辣根过氧化物酶，嗜酸粒细胞过氧化物酶等)能催化H2O2 和Cl-反应生成HOCl, NO2-可被HOCl氧化生成NO2Cl和NO2使酪氨酸发生硝基化反应；还能使亚硝酸盐和酪氨酸同时被氧化，分别生成NO2-和酪氨酰自由基（Tyr。）,后两者继续反应生成3-NT1。铜/锌-过氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）催化途径：尽管不同的SOD有明显的保护作用，可是它也有产生强氧化物质的能力，导致细胞组织的损伤。近来的研究显示，在生理性PH范围内，Cu/ZnSOD可以作为一种过氧化物酶。当体内HCO3大量存在时，Cu/Zn-SOD能催化亚硝酸盐/ H2O2生成NO2和CO3，后两者继续氧化和硝化酪氨酸残基，生成多种酪氨酸衍生物，包括3-NT。过氧化氢酶（Catalase）依赖途径：，叠氮化钠（NaN3）是过氧化氢酶的抑制剂，但在过氧化氢酶和H2O2共同存在时又是NO供体，发生氧化反应引起酪氨酸硝基化 。在体外试验中发现，叠氮化物（azide）/ H2O2共存在时过氧化氢酶能够使牛血清白蛋白的酪氨酸残基或游离酪氨酸硝基化。血红蛋白催化(Hemoglobin)途径:血红蛋白是红细胞的主要组成部分，在生理状态下是一种ONOO的清除剂。然而，Grzelak等2研究发现用亚硝酸盐/H2O2培养的人血红蛋白诱导自身硝基化并且硝化了牛血清白蛋白。假如，血红蛋白具有过氧化物酶的活性并通过类似过氧化物酶的机制使酪酸硝基化，那么它的这种催化特性对血循环中蛋白质硝基化是非常重要的，目前尚未进行这方面的研究。二、3-NT的检测 在应激和炎症等病理条件下，多种组织（如肺，肝脏，血管内皮等）中可以检测到3-NT的存在，后者的生成与定位可反映体内酪氨酸硝基化的产生与分布。分析法、免疫反应法和两者结合的方法被用于定性、定位和定量检测3-NT。分析法：包括高性能液体色谱法（HPLC）,气体色谱/质光谱测定法（GC/MS）和液体色谱/质光谱测定法（LC/MS），主要用于定量分析酪氨酸硝基化.Zhu 等3已成功地使用HPLC的方法定量测定ARDS患者肺组织中3-NT（约400-500pmol/mg protein）。免疫反应方法：包括免疫组织化学（Immunohistochemistry）, 酶联免疫吸附（ELISA） 免疫细胞化学（Immunocytochemistry）和Western Blot的方法，主要用于定性/定位检测酪氨酸硝基化。用Immunohistochemistry的方法，Nagata等4在内毒素诱导的急性肺损伤研究中检测到肺组织3-NT的阳性信号主要分布在肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞；在ARDS患者的支气管肺泡灌洗液中，Sittipunt等5用Immunocytochemistry和ELISA的方法同时检测到3-NT 的存在 ；Bermejo 等6在LPS诱导感染性休克的大鼠模型中，用Western Blot的方法在血管组织匀浆中检测到酪氨酸硝基化蛋白表达明显升高。三、酪氨酸硝基化导致细胞功能损伤的机制 研究发现，人类的多种疾病如动脉粥样硬化、ALI/ARDS、感染性休克、缺血-再灌注损伤、帕金森症、肾器官移植排斥、慢性肾衰竭等均与酪氨酸硝基化有关。目前，酪氨酸硝基化在疾病发生中可能的作用如下：体内许多有重要功能的酶或蛋白被硝基化后，结构发生改变并且功能受损/活性下降，很可能与组织细胞损伤关系密切。Mn-SOD是一种线粒体抗氧化酶，能够清除过多的氧化应激产物如O2-，在人类同种异体肾移植慢性排斥的研究中发现，肾小管上皮细胞中Mn-SOD表达与对照组相比增加，而Mn-SOD的Try-34被硝基化后，酶活性明显下降,失去对上皮细胞的保护作用。肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)是肺泡型上皮细胞合成分泌的表面活性物质，能够抑制内毒素刺激巨噬细胞分泌的IL-1及TNF并防止肺水肿、肺萎陷。Zhu等 7在对ALI/ARDS患者肺水的研究中提出ONOO-和TNM使SP-A发生硝基化，使SP-A上述的功能受到抑制，很可能是ALI/ARDS发病机制之一。血管内皮细胞除了作为血管屏障，还能够合成并释放多种体液因子，在调节血流动力学、血细胞黏附和血管张力中发挥重要作用，内皮细胞破坏或功能障碍，血管屏障丧失，通透性增加，而且一些内皮细胞依赖的调节机制也失常。环前列腺素合酶（PGI2）由内皮细胞产生，具有抗血栓形成、抗增生和舒张血管的作用。Zou 等8在动脉粥样硬化和缺血再灌注的牛冠状动脉中发现，PGI2被硝基化后，失去上述活性，导致前列腺素H2（PGH2）蓄积，可能引起血管痉挛并促进了血小板聚集和血栓形成。线粒体内有重要功能的物质如Mn-SOD、细胞色素C、电压依赖的阴离子通道、ATP酶和琥珀酰CoA等硝基化后，抑制呼吸链的传递，使线粒体的ATP合成减少，导致细胞内能量耗竭9，从而影响细胞的功能甚至凋亡和坏死。Murata等10提出游离3-NT通过诱导H2O2的产生介导DNA损伤，影响蛋白质的转录合成，导致细胞功能受损。酪氨酸磷酸化在细胞信号传到中有重要的调节作用，抑制酪氨酸磷酸化也可以损伤细胞功能。蛋白酪氨酸激酶参与调节细胞增生、分化和免疫系统信号传导过程，多种具有酪氨酸激酶活性的受体的胞浆内段都含有酪氨酸残基，该残基磷酸化后方能介导信号传递，而酪氨酸残基硝基化后抑制了其磷酸化，导致信号过程的失控，引起炎症反应和疾病。免疫过程中，Ag/TCR/CD3复合物激活的最早的细胞内信号通路是由蛋白酪氨酸激酶介导的酪氨酸磷酸化，Brito 等11用健康志愿者的T淋巴细胞和ONOO做体外试验，证实ONOO使淋巴细胞中的酪氨酸残基硝基化，抑制了它们的磷酸化反应，剂量依赖性地抑制T淋巴细胞的增殖和活化，导致免疫系统功能失调。可见，酪氨酸硝基化很可能通过抑制酶/蛋白功能、损伤线粒体/DNA等一种或多种途径损伤组织细胞，成为多种疾病的发生和发展中的一种新机制。四、防治酪氨酸硝基化的可能途径1、使用NOS抑制剂减少NO的产生。如应用糖皮质激素、一些细胞因子(IL-4、IL-8、IL-10、TGF-等)抑制或阻断iNOS的表达，减少NO的生成。亚甲兰系氧化还原剂，本为解毒药物，临床主要用于治疗硝酸盐、醌类、硝基苯等引起的高铁血红蛋白血症及治疗氰化物中毒，近年来证实，亚甲兰尚具有抑制iNOS表达及捕捉NO的功能、抑制内毒素诱导的TNF-合成、抑制氧自由基等作用。2、使用抗氧化剂或ONOO的捕捉剂。如维生素E（生育酚）、维生素C（抗坏血酸）、尿酸、谷光甘肽是机体抗氧化系统的重要组成部分，N-乙酰-5-甲氧基色胺，又称褪黑激素，是松果体分泌的一种吲哚类物质，属于广谱的活性氧和活性氮的清除剂。相同剂量下的抗氧化作用是维生素C、维生素E的数倍，能抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，降低黄嘌呤氧化酶和髓过氧化物酶的活性12，同时也能抑制由ONOO引起的酪氨酸硝基化13。3、催化ONOO的降解，使之成为无害的硝酸盐。研究中发现加入铁卟啉化合物至溶液中能减少ONOO-的存在时间，继而产生的显著的离子分布移位，使ONOO-趋于转化成硝酸盐。由于卟啉化合物具有使ONOO-高度异构化的特征，其与金属离子的复合物可望成为降解ONOO-的临床用药。在肠源性休克的大鼠模型上14，铁卟啉化合物（FeTMP）治疗组大鼠肠道ONOO-的标志物3-NT的量明显减少，组织中P蛋白和ICAM-1的表达减少，生存率提高。近两年，一种新型的ONOO-分解催化剂FP-15问世，Bianchi15等人发现FP-15可明显减少ONOO-的毒性，降低心肌缺血再灌注损伤的心肌梗死范围并能降低反应性充血。五、小结 综上所述，在体内，酪氨酸硝基化途径不是唯一的，而且可能不是相互独立而是同时发生。基于生物体的复杂性，对于每种疾病，很可能必须分别地探讨酪氨酸硝基化在其中的作用。与此同时，体内硝基化的机制仍然在研究中并且存在很多争议，并期望能找到一种直接抑制酪氨酸硝基化的方法，对于治疗相关疾病开辟一条新的途径。