柑桔原生质体操作 一、材料的准备1. 胚性悬浮系的建立： 从固体培养基上取继代20天左右生长旺盛的愈伤组织于MT +ME 0.5g /L+ 谷氨酰胺1.5 g/L +蔗糖 40g/L 的液体培养基中 （每瓶50 ml），100转振荡培养，每两周继代一次，3 代后用于分离原生质体。2.无菌苗的获得：柑桔种子无菌条件下播种于MT培养基上，20-30天后叶片充分展开后用于分离原生质体。二、原年质体的分离1. 悬浮系原生质体的分离： 用吸管吸取1g 左右的继代6-10 天的悬浮培养物于15x60 mm的培养皿中，吸干培养基，加入1.5 ml 0.7 EME 和1.5 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28暗条件下酶解16-24小时。2. 叶肉原生质体的分离：1.5 ml 0.6 EME 加入一15x60 mm的培养皿中，在此培养皿用解剖刀将叶片切成0.05-0.1cm的细条，后加入1.5 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28暗条件下酶解16-24小时。三、 原生质体的纯化：1. 酶解后的原年质体经孔径为45 m 的不锈刚网去掉渣质,CPW13 洗涤以收集大量原生质体,滤液在10ml 离心管中离心（100转）10分钟，使原生质体沉于管底。2. 沉淀物用3ml CPW25 悬浮，在其上轻轻加入1ml CPW13 ，100转离心2-6 分钟，原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。（注：如果此种情况下无法形成界面，则原生质体沉淀物用CPW13 悬浮）3. 将原生质体轻轻吸出，置于另一离心管中，用电融合液离心洗涤6-8分钟，去掉上清液，用电融合液悬浮至5-10 x 105 个/ml 备用。（用血球计数板调密度，一个大方格中原生质体数x10000即是原生质体密度）四、原生质体活性检查FDA用丙酮配制成5 mg/ml 的浓度。按25 l FDA /ml 原生质体的比例加入FDA，5 分钟后在万能显微镜下检查原生质体活性（暗视野下发荧光原生质体数/明视野下原生质体总数）。注：叶肉原生质体发红色荧光，而悬浮原生质体发黄色荧光。五、原生质体融合一） PEG法1. 将悬浮好的双亲原生质体等体积混合2. 用吸管滴2 滴混合好的原生质体于15 x 60cm 塑料培养皿中央，立即加入40% 的PEG 2 滴诱导融合3. 10 分钟后，加入稀释液（9A/1B）2 滴4. 15 分钟后，从边缘缓缓加入 12 滴EME 培养基，保持20分钟后用吸管沿边缘小心移走5. 从边缘再加入15滴EME 培养基，保持10分钟后小心移走。6. 重复步骤5 两次7. 最后加10-15滴BH3 培养基，在培养皿中央形成一小池，沿培养皿边缘加入15-20滴BH3 培养基，保持培养皿内的湿度，封口膜封口。二） 电融合法1. 将双亲原生质体用电融合液悬浮，混合备用（胚性愈伤组织原生质体1-5 x 105 个/ml； 叶肉原生质体10-20 x 105 个/ml）.2. 融合小室先用融合液洗涤，以防原生质体聚集于电极两侧的角落里，然后取大约 0.8 ml （FTC-03）或 1.6 ml （FTC-04）悬浮液于环形融合小槽，融合小室中央加几滴电融合液以保持湿度，parafilm 封口。3. 静置5-10分钟，待大量原生质体沉淀后，在选择好的电融合参数下诱导融合，倒置显微镜下观察融合过程。4. 融合后，静置15-20分钟以利于融合的原生质体圆球化。5. 轻轻吸出融合产物于10 ml 离心管中离心5-6 分钟，用培养基悬浮至0.5-1 x 105 个/ml .六、原生质体培养1. 原生质体培养常采用液体浅层培养或固体包埋培养法。2. 原生质体培养在暗培养箱中进行，3-10天后原生质体再生细胞壁，并开始第一产次分裂。3. 等原生质体分裂形成多细胞团时（大约20-30天），开始降低培养基的渗透压，具体：1） 各加入5-10滴0.6 M BH3和0.3M EME培养基，降压至0.45 M2) 7 15 天后再各加入5-10滴0.6 M BH3和0.3M EME培养基，降压至0.3 M3）此后要及时稀释，降低细胞团的浓度，以利于胚状体发生，等细胞团长到一定大小时，转入EME500上诱导胚状体的发生。4）细胞团长出球形胚、心形胚后，及时转入EME 1500培养基上，以利于胚状体的进一步发育和转绿。5）将发育到子叶胚时期的胚状体转入生芽培养基（MT+BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA 0.1mg/L）中诱导丛生芽。6）将丛生芽转入生根培养基(1/2MT+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L)中诱导生根或嫁接到试管中的砧木上。7）再生苗的鉴定及移植于温棚中。 七、再生苗的鉴定方法1 形态学观察：叶形、气孔等。2 细胞学观察：海氏苏木精法3 分子标记鉴定：RAPD，AFLP，SSR，CAPS，RFLP等八、相关培养基的配方1. 酶液混合液（仅供参考，不同时间购买的酶活力不同，故浓度会有不同程度的变化） 40ml 60ml 甘露醇（12.7%） 5.10g 7.68g NaH2PO4.2H2O (0.011%) 0.0044g 0.0066gCaCl2.2H2O (0.36%) 0.144g 0.216gMES (0.12%) 0.048g 0.072gCellulase R-10 (1.5%) 0.6g 0.9%离析酶 R-10 （3%） 1.2g 1.8g2. EME 培养基：MT+500mg ME（麦芽提取物）0.3 EME: MT+500mg ME/L+ 102.5 g 蔗糖/L0.6 EME: MT+500mg ME/L+ 205.38 g蔗糖/L0.7 EME: MT+500mg ME/L+ 239.61 g蔗糖/LEME 500: MT+500mg ME/L+50g蔗糖/L+7g 琼脂/LEME 1500: MT+1500mg ME/L+50g蔗糖/L+7g 琼脂/L3. 电融合液 （100ml） 甘露醇 (0.7M): 12.74g 无水CaCl2 (0.25mM): 0.02775g PH值：5.8 ,高压灭菌4. CPW stock I (100ml) CPW stock II (100ml) KH2PO4 0.272g 无水CaCl2 1.5g KNO3 1.0g MgSO47H2O 2.5g KI 0.002g CuSO45H2O 0.00003g CPW13 (100ml)： CPW stock I 1ml + CPW stock II 1ml +13g 甘露醇 CPW26 (100ml): CPW stock I 1ml + CPW stock II 1ml + 26g 蔗糖5 PEG 融合液（100ml） PEG (分子量 6000) 40g H2O 80ml 无水CaCl2 0.97g Glucose 5.41g 定溶至 100ml，加热溶解，PH 6.0，过滤灭菌6稀释液A ： Glucose 7.21g 稀释液 B: Glycine 2.25g ( 100ml) 无水CaCl2 0.97g PH 10.0 过滤灭菌 （KOH） DMSO 10mlPH 6.0 过滤灭菌 使用前按9A:1B混合澄清。7 BH3培养基( 1升)ME蔗糖甘露醇谷氨酰胺MgSO47H2OKH2PO4KClMT 微量元素MT Ca +MT vit +MT 铁盐 各水解酪蛋白Vit Stock AVit Stock BKI Stock有机糖贮存液有机酸贮存液椰子汁1.0g51.34g81.99g3.1g0.37g0.17g1.5g10ml10ml0.25g2.0ml1.0ml1.0ml10ml10m20ml定容到1000 ml， pH5.8 过滤灭菌KI stock75 mg/ 100ml有机酸贮存液(mg/100ml)丙酮酸钠盐200柠檬酸400苹果酸400延胡索酸400有机糖贮存液果糖核糖木糖甘露醇鼠李糖纤维二糖半乳糖甘露醇(mg/100ml)25002500250025002500250025002500Vit stock AMg/100ml生物素1核黄素10叶酸20对氨基苹果酸1氯化胆碱50VC100Caloium pantathenase50Vit Stock BMg/100mlVit A1Vit D31Vit B122