蛋白质提取、纯化、鉴定的方法(二)一、层析技术1.离子交换层析的亲和洗脱 这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某 一 pH时，目的蛋自质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除 了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱,该配体特异 性地结合目的蛋白质并使之洗脱,但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。 注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交 换剂之间的电荷相互作用。2固相金属亲和层析 重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6 个组氨酸残基(His-tag)。这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+ 或Co2+形成配位键。用固相化的Ni2+或 Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带 有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。 注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台,但较弱，因此可用低浓 度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如 DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三 价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化 蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的 是酸性蛋艸也可被不同程度地吸附。3. 凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠(bead)中有大小 不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不 仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长 而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而，分子量相 近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。 然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基 组成，PKM2在细胞中以三种形式存在单体、二聚体、四聚体，这三种形式 的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细 胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Wes tern blot对每一种形式的PKM2做 相对定量。4. 反相层析 该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正 相而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanol group)，硅羟 基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相 柱上的时间越长。反相层析则在固相表面引入不同长度的烷基(C4,8,12,18), 使固相表面呈疏水性，烷基与被分离的化合物表面的疏水基团相互作用。不同的 蛋白质分子表面的疏水基团量和空间分布不同,因此不同蛋白质的疏水性不同, 疏水性越强,在反相柱上的滞留时间越长,疏水性越弱,在反相柱上的滞留时间 越短。用反相层析技术可将疏水性不同的蛋白质分开。反相层析的分辨率非常高, 若不考虑蛋白质的活性,反相层析是非常有效的分离和纯化的手段。反相层析技 术也可用于鉴定蛋白质纯度。反相层析技术串联质谱是当今鉴定蛋白质分子的重 要手段。要注意的是,该技术对样品的制备要求非常高,样品必须是纯净无颗粒 物,样品制各的质量直接影响分离,若样品制备差,会直接损毁柱子；要考虑反 相柱的孔径(pore size),选择适合分离蛋白质的反相柱。二、电泳分离技术1.SDS-PAGE 常用于鉴定蛋白质的纯度和分子量,也可用于蛋白质的纯化。SDS-PAGE 凝胶分为两层,上层为浓缩胶,下层为分离胶。浓缩胶的作用是 将样品中的蛋白质压成个薄层，分离胶将各种分子量不同的蛋白质分开。SDS带 负电，当SDS与蛋白质混合后，SDS与蛋白质分子结合形成复合物，复合物中SDS 所带的负电荷大大超过了蛋白质分子所带的电荷,因此在电泳时,蛋白质电泳速 率与蛋白质分子量的对数成反比，而蛋白质所带电荷对电泳速率的影响可忽略不 计。 SDS-PAGE 的分辨率非常高。该技术要注意4点： 配胶时，所有溶液都要脱气。丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺的交联 需要自由基的催化，自由基由过硫酸铵和TEMED (四甲基乙二胺)产生。空气中的 氧气可有效清除由过硫酸铵和TEMED产生的自由基，因此抑制丙烯酰胺-亚甲基 双丙烯酰胺的多聚化(polymerization)。不脱气也将导致凝胶质量的批次间差 异。 SDS的质量非常重要，SDS中的不纯物(CIO, C14，C16 alkyl sulfate) 可导致一个蛋白质形成多个条带。 SDS不要过量，如3050p l样品中SDS量不要多于200g，不然蛋白质 的条带会变宽，影响分辨率。 过硫酸铵不稳定，需在使用前配制。2.等电聚焦 蛋白质是两性电解质，当某个蛋白质在某一 pH值时，其所带正 电荷和负电荷数相等，净电荷为零，这一 pH值就是该蛋白质的等电点。各种蛋 白质的碱性和酸性氨基酸残基的量存在差异，这种差异导致蛋白质的等电点不 同。根据这一特性可将等电点不同的蛋白质用等电聚焦方法分离。IEF也可用于 分离修饰与否的蛋白质，如蛋白质可被磷酸化（加入电荷）、乙酰化（中和电荷）, IEF可将修饰与否的蛋遊分离开（反相层析法也可以）。IEF对样品的制备要求 是，要预防同种或不同种蛋白质形成蛋白复合物，尽可能去除样品中的非蛋白质 离子。在分离和鉴定复杂的蛋白质成分时（如细胞裂解液），常常用双向电泳，第一 向是IEF，将不同等电点的蛋白质分离,与之垂直的第二向是SDS-PAGE，按分子 量将蛋白质分离。双向电泳可以将细胞中的蛋白质分离成数千个组分，对分离到 的蛋白质组分做质谱分析，可快速鉴定蛋白质的身份。注意，分离到的组分不。 定代表单个蛋白质。