结核杆菌概述 微生物专业 张茜 2010112292窗体底端 结核分枝杆菌（M. tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli）。早在1886年，德国细菌学家Koch就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5%10%携带者可发展为活动性结核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高3050倍，且结核的病程发展更快。此外，在HIV感染的发展进程中，结核是最早发生的一种机会性感染，结核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。目前全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。我国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。一、生物学性状（一）形态染色结核杆菌细长略弯曲，端极钝圆，大小约140.4um ，呈单个或分枝状排列，无荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。结核杆菌一般常用萎钠氏（Ziehl-Neelsen）抗酸性染色法染色，结核杆菌染成红色，其他非抗酸性细菌及细胞浆质等呈蓝色。结核杆菌的抗酸性取决于胞壁内所含分枝菌酸残基和胞壁固有层的完整性有关。（二）培养特性结核杆菌为专性需氧菌。营养要求高，在含有蛋黄、马钤薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长。最适ph 6.56.8 ，最适温度为37，生长缓慢，接种后培养34周才出现肉眼可见的菌落。菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、乳酪色或黄色，形似菜花样。在液体培养内呈粗糙皱纹状菌膜生长，若在液体培养基内加入水溶性脂肪酸，如Tween80，可降低结核杆菌表面的疏水性，使呈均匀分散生长，此有利于作药物敏感试验等。（三）抵抗力结核杆菌对某些理化因子的抵抗力较强。在干痰中存活68个月，若粘附于尘埃上，保持传染性810天。在3%HCI或NaOH溶液中能耐受 30分钟，因而常以酸硷中和处理严重污染的检材，杀死杂菌和消化粘稠物质，提高检出率。但对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。在液体中加热626315 分钟，直射日光下23小时，75%酒精内数分钟即死亡。（四）变异性结核杆菌对链霉素、利福平、异烟肼等抗结核药物较易产生耐药性。耐药菌菌株常伴随活力和毒力减弱，如异烟肼耐药菌株对豚鼠的毒力消失，但对人们仍有一定的致病性。卡介（Calmette-Gerine）二氏将牛型结核杆菌培养于胆汁、甘油、马铃薯培养基中，经230次传代，历时13年，使其毒力发生变异，成为对人无致病性，而仍保持良好免疫性的菌苗株，称为卡介菌（Bacilli Calmette-Giierin，BCG）。卡介菌接种人体后，可获得抗结核受疫力。（五）菌体成份与作用结核杆菌无内毒素，也不产生外毒素和侵袭性酶类，其致病作用主要靠菌体成份，特别是胞壁中所含的大量脂质。脂质含量与结核杆菌的毒力呈平行关系，含量愈高毒力愈强。1.脂质（Lipid）：脂质占菌体干的2040%，占胞壁干重的60%，主要是磷脂、脂肪酸和蜡质，它们大多与蛋白质或多糖质结合成复合物存在。磷脂能刺激单核细胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶组织溶解不完全，形成干枯样坏死。脂肪酸在脂质中比重较大，其中6，6二分枝酰a，a海藻糖（6，6Dimycocyla，aDtrehalose）具有破坏细胞线粒体膜，毒害微粒体酶类，抑制中性粒细胞游走和吞噬作用，引起慢性肉牙肿。具有该物质的结核杆菌毒株，在液体培养基中能紧密粘成索状，故称为索状因子（cordfactor）。蜡质D为胞壁中的主要成分，是一种肽糖脂（Piptidoglycolipids）与分枝菌酸（My-colic acid）复合物，能引起迟发型变态反应，并具有佐剂作用。硫酸脑苷脂（salfatides）和硫酸多酰基化海澡糖（Multiasiylated trehalose salfate）在结核杆菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合，使结核杆菌在细胞内存活。这一类糖脂能结合中性红染料。产生中性红反应，借此可鉴定结核杆菌有无毒力。2.蛋白质（Protein）：结核杆菌菌体内都含有数种蛋白质，其中重要的蛋白质是结核菌素（tuberculin）。结核茵素与蜡质D结合，能引起较强的迟发型变态反应。其他蛋白质可引起机体产生相应的抗体，但无保护作用。3.多糖质（polysaccharides）：多糖质常与脂质结合存在于胞壁中，主要有半乳糖，甘露醇、阿拉拍糖等。多糖质可使中性粒细胞增多，引起局部病灶细胞浸润。4.核酸（Nucleic acid）：结核杆菌的核糖体核糖核酸（Ribonucleie acid ribosonic， rRNA）是本菌的免疫原，刺激机体产生特异性细胞免疫。1998年英国Sanger中心和法国Paseteur研究所科学家合作完成了结核分枝杆菌H37Rv株的全基因组测序工作。结核杆菌全基因组序列由4.41Mb(4.41529bp)组成，包括4411个基因，具有潜在编码能力的基因约有3977个，约占90.2%。有3924个开放阅读框，其中约40%有功能，44%可能有功能，16%称为孤独序列，与其他微生物的序列无相似性。基因组富GC碱基，G+C含量高达65.6%。2001年10月，完成了对结核杆菌CDC1551全基因组的测序工作。结核分枝杆菌全基因测序工作的完成为结核病病原菌致病基因的各种研究提供了极好的机遇。二、致病性结核杆菌的致病作用可能是细菌在组织细胞内顽强增殖引起炎症反应，以及诱导机体产生迟发型变态反应性损伤有关。结核杆菌可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官，引起相应器官的结核病，其中以肺结核最常见。人类肺结核有两种表现类型。（一）原发感染原发感染是首次感染结核杆菌，多见于儿童。结核杆菌随同飞沫和尘埃通过呼吸道进入肺泡，被巨噬细胞吞噬后，由于细菌胞壁的碳酸脑苷脂抑制吞噬体与溶酶体结合，不能发挥杀菌溶菌作用，致使结核杆菌在细胞内大量生长繁殖，最终导致细胞死亡崩解，释放出的结核杆菌或在细胞外繁殖侵害，或被另一巨噬细胞吞噬再重复上述过程，如此反复引起渗出性炎症病灶，称为原发灶。原发灶内的结核杆菌可经淋巴管扩散在肺门淋巴结，引起淋巴管炎和淋巴结肿大，X线胸片显示哑铃状阴影，称为原发综合征。随着机体抗结核免疫力的建立，原发灶大多可纤维给的钙化而自愈。但原发灶内可长期潜伏少量结核杆菌，不断刺激机体强化已建立起的抗结核免疫力，也可作为以后内源性感染的来源。只有极少数免疫力低下者，结核杆菌可经淋巴、血流扩散至全身，导致全身粟粒性结核或结核性脑膜炎。（二）继发感染继发感染也称原发后感染，多见于成年人。大多为内源性感染，极少由外源性感染所致。继发性感染的特点是病灶局限，一般不累及邻近的淋巴结，主要表现为慢性肉芽肿性炎症，形成结核结节，发生纤维化或干酪样坏死。病变常发生在肺尖部位。三、免疫与变态反应结核杆菌的免疫原rRNA和变应原结核菌素可诱发机体产生由T淋巴细胞介导的两种免疫应答反应，即细胞免疫和迟发型变态反应。（一）免疫性人类对结核杆菌的感染率很高，但发病率却较低，这表明人体感染结核杆菌可获得一定的抗结核免疫力。抗结核免疫力的持久性，依赖于结核杆菌在机体 内的存活，一旦体内结核杆菌消亡，抗结核免疫力也随之消失，这种免疫称为有菌免疫或传染性免疫（Infection immunify）。抗结核免疫主要是细胞免疫，包括致敏的T淋巴细胞和被激活的巨噬细胞。致敏的T淋巴细胞可直接杀死带有结核杆菌的靶细胞，同时对释放多种作用于巨噬细胞的淋巴因子，使巨噬细胞聚集在病灶周围形成以单核细胞为主的增生性炎症。被激活的巨噬细胞极大地增强对结核杆菌的吞噬消化，抑制繁殖，阻止扩散， 甚至消毁的能力，充分分挥细胞免疫的作用。（二）免疫与变态反应的关系在结核杆菌感染时，细胞免疫与迟发型变态反应同时存在，此可用郭霍氏现象（Kochs phenomenton）说明，在健康豚鼠皮下首次注射一定量结核杆菌，1014天后注射部位缓慢地出现溃疡，深而不易愈合，邻近淋巴结肿大，细菌散至全身，此时结核菌素测试为阴性。用相同等量的结核杆菌注入曾感染已康复的豚鼠皮下，在12天内即迅速发生溃疡，但溃疡浅而易愈合，邻近淋巴结不肿大，细菌也很少扩散，结核菌素测试为阳性。在康复的豚鼠皮下注射大量结核杆菌，则引起注射局部及全身严重的迟发型变态反应，甚至导致动物死亡。上述三种现象表明，首次感染出现的炎症反应偏重于免疫预防，溃疡浅而愈合，细菌不扩散，说明机体尚未建立起抗结核免疫力；再次感染发生的炎症发应则偏重于免疫预防，溃疡当浅而愈合，细菌不扩散，说明机体对结核杆菌已具有一定的细胞免疫力，而溃疡迅速形成，则说明在产生免疫的同时有迟发型变态反应，表现出对机体有利的一面；用过量的结核杆菌进行再次感染，则引起剧烈的迟发型变态反应，说明迟发型变态反应对机体不利的一面。人类的原发性肺炎结核，继发性肺结核，严重而恶化的肺结核，相当于郭霍氏现象的三种情况。近年来，实验研究证明结核杆菌细胞免疫与迟发型变态反应是由不同的T淋巴细胞亚群介导和不同的淋巴因子承担的，是独立存在的两种反应。从小鼠实验表明，结核杆菌感染的细胞免疫应答为Lytl+-2和Lytl2T淋巴细胞，而迟发型变态反应则为Lytl+2T淋巴细胞。取结核杆菌rRNA 免疫小鼠的T淋巴细胞与rRNA共育的上清中不含巨噬细胞移动抑制结核杆菌繁殖抑制因子（Myco IF）；但用结核杆菌减毒活菌标（H37RV）免疫小鼠的T淋巴细胞与PPD共育，其上清中则含有MIF，而与H37RV共育的上清液不仅含有MIF而且 含有Myco IF.这两种免疫小鼠都用结核杆菌强毒株攻击，他们都获得相等程度的免疫力，故认为抗结核细胞免疫是由Myco IF承担，而与MIF无关。本试验用于测定机体对结核杆菌有无变态反应。将一定是结核菌素注入皮内，如受试者曾感染结核杆菌，则在注射部位出现迟发型变态反应炎症，是为阳性，未感染结核杆菌则为阴性。此法可用检测可凝病人曾否感染结核菌，接种卡介苗后是否阳转以及检则机体细胞免疫功能。结核菌素试验一般使用旧结核菌素（Old-tubercein简称OT），是结核杆菌在肉汽中培养物经加热浓缩的滤液。主要成分是结核蛋白，也含有结核杆菌的其他代谢和培养基成分。稀释1万倍，0.1毫升内含有1个单位（稀释1000倍，0.1ml 有10个单位），取OT结核蛋白纯化后称为精制纯蛋白衍生物（Purified protein derivative ，简称PPD ），取0.00002ml作为一个结核菌素单位，是现今国际制造的标准PPD，称为PPD-S.试验法常规使用5个单位OT（2000倍稀释0.1ml） 或PPD-S0.0001mg注入受试者前臂掌侧皮内，4872小时内出现红肿硬节直径大于5毫米者为阳性，虽有红肿但无硬结或硬结直径不到5毫米者为阴性。应