实验十三细菌鉴定中常用的生理生化试验一、实验目的1、了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性；2、掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。二、基本原理各种微生物在代谢类型上表现有很大的差异，表现在对生物大分子糖类和蛋白质分解能力，以及最终代谢产物的不同，反映出它们具有不同的酶系。微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物，因此，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 微生物生化反应的多样性一是使自然界的有机分子都有可能得到分解，二是使不同微生物之间有了相互作用和依赖的基础。微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质降解，胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为小的化合物，使其能被运输至细胞内。三、实验器材1、菌种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌，普通变形杆菌2、培养基固体油脂培养基、固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基3、溶液或试剂革兰氏染色用碘液，酚红，溴甲酚紫4、仪器及其他用具无菌平板、无菌试管、接种环、接种针、试管架四、实验方法及步骤（一）淀粉水解实验试验方法：以18-24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区划“+“字接种，）或直接移种于淀粉肉汤中，于361培养24-48h，或于20培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。（二）明胶水解试验有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。方法：挑取18-24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20-22培养7-14天。明胶高层亦可培养于361。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10-20min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。（三）糖类发酵试验 可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。 流程：发酵液试管标记接种培养观察记录 1.操作前注意观察未接种细菌的正常单糖发酵管状况。 2、接种培养 以无菌操作分别将少量菌苔接种于乳糖发酵管及葡萄糖发酵管中； ，每种糖发酵管的空白对照均不接菌。置37恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h观察结果。 3、观察记录 与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“”表示。 （四）乙酰甲基甲醇试验(VP试验) 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。 流程：培养液试管标记接种培养观察记录 1、标记试管 取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 2、接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养2448h。 3、观察记录 取出以上试管，充分振荡2min。每管分别加入40NaOH溶液1020滴，并加等量-奈酚，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37恒温箱中保温1530min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“”表示）。 注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。 （五）甲基红试验（M.R.试验） 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。 .流程 培养液指示剂观察记录结果 于V.P.试验留下的培养液中，各加入23滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“”或“”表示。 （六）吲哚试验 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。 流程：标记试管接种培养观察记录 1、试管标记 取装有蛋白胨水培养液的试管5支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 2、接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37恒温箱中培养2448h。 3、观察记录 在培养液中加入乙醚12ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“”、阴性用“”表示。 五、注意事项1.要严格按照培养基配方配制培养基，防止杂菌污染。2.观察结果时要注意滴加药量及反应时间。六、实验报告1、记录生理生化反应测定结果 2、你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？3、不利用碘液，你怎么证明淀粉水解的存在？4、假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵实验应该出现什么结果？5.哪些生理生化试验可用于区别大肠杆菌和产生肠杆菌?结果如何?6.做糖发酵试验时应注意哪些问题?7.甲基红试验和伏一普试验的最终产物如何?为什么会出现不同的最终产物?