在低氮胁迫下水稻剑叶基因转录因子表达的变化摘要：对低氮胁迫的转录因子基因反应的研究，为提高氮肥在水稻的吸收和利用效率提供分子基础。安捷伦水稻基因组芯片被用来研究了在低氮胁迫下两个水稻品种（SN 196和Toyonishhiki ）转录因子基因表达的变化与叶绿素含量含量的变化。结果表明，在低氮胁迫下超绿水稻品种SN196剑叶共有53个转录因子基因（ 35个下调，18上调）至基因转录水平上，在Toyonishiki品种剑叶中27转录因子基因（21个下调， 6个上调至基因转录水平）。在这些氮反应基因中，SN196品种中48个转录因子基因和在Toyonishiki 中22个转录因子基因变化显著。低氮胁迫下SN196和Toyonishiki之间，有重叠的转录因子基因响应。，1上调和4个下调至转录水平。在两个水稻品种之间低氮反应染色体的基因分布是不同的。 水稻是中国种植面积最大，产量最高利用氮肥最多的粮食作物之一。2002年，水稻在中国种植面积达到2.85107hm2，占世界水稻种植总面积在的20，但在中国水稻种植区使用氮肥的量比世界平均水平多30%。大量氮肥的应用降低肥料的利用率，造成了能源的极大浪费，增加了食品成本，严重影响了农民生产粮食的积极性，更重要的是，造成严重的环境污染。因此，如何提高水稻的氮素吸收效率，减少氮肥的施用量，同时仍保持高产稳产是近年来研究的热点（美，1997; Inthapanya等，2000; Koutroubas和Ntanos，2003年）问题。 植物转录因子在植物生命活动起着重要作用。由于首次在玉米中发现，之后就有数以百计的植物转录因子被发现，并在水稻至少有2 300转录因子，在水稻生长和发展中起着重要作用。以往的研究结果表明，通过一系列的应激相关基因（ Jaglo -的Ottosen等，1998 ;春日等，1999 ;筱崎等人， 2000 ;陈等人， 2002）的调整，植物转录因子影响了植物胁迫耐受性。到目前为止，已知的转录因子与一系列抗逆基因，对抗低温，干旱，盐和疾病（ Maleck等密切相关，2000 ;参数在线等，2001 ; Singhet人，2002年; Aharoni等，2004 ;陈等人，2004;金，2006 ;廉等人，2006 ; Zhao等， 2011） 。利用全球基因组表达芯片分析，廉等人（ 2006）表明，在低氮胁迫，在水稻根系发生变化11转录因子中有5个上调基因和6个下调基因，这就说明转录因子表达水平也与低氮胁迫密切相关。然而，这些结果只限于在低氮胁迫下苗期水稻。据悉，水稻叶片叶绿素含量与氮供应密切相关（武罗，1996; Li等人， 2003 ） 。因此，氮限制条件下，叶绿素含量的差异反映氮素吸收效率和叶绿素合成的差异。本研究利用水稻基因芯片技术研究水稻在抽穗期剑叶中转录因子的氮胁迫响应差异和叶绿素含量，以便更好地了解作物对低氮胁迫的反应及其机制，并为提高水稻氮肥吸收和利用效率提供参考。材料与方法超绿水稻SN196，是沈阳农业大学水稻研究所超级稻育种实践中发现的一叶色突变体。经过几年的不断自我繁殖，性状稳定表现特点为深绿色色，生长过程中叶片中具有高叶绿素含量。Toyonishhiki 是一个普遍的日水稻品种，其叶绿素含量显著低于SN196。这两种材料的相关特性已经被研究过了（Sui等，2010）。材料的培养 该实验的实验基地在沈阳农业大学，中国水稻研究所。水稻种植在30厘米的开口直径的塑料盆内，在20厘米的直径，且为26厘米的高度。每盆含13.5千克土壤且充分混合，过筛，干燥。土壤为砂质壤土为29.8毫克/克有机质含量， 总氮含量1.11-1 .28毫克/克。总p含量为2.80毫克/克，总K含量为34.0mg /克， 水解氮含量30.0微克/克，和速效磷含量5.90微克/克。尿素CO（ NH 2 ）2，氮含量： 46.7 被用作氮肥。低氮胁迫处理被定为N0 （0克/千克） 。正常氮肥处理设置为N1（0.15克/千克）作为对照。过磷酸钙Ca（ H 2 PO 4 ）2 H 2 O ，磷含量：18 作为磷的肥料和KCl作为钾的肥料。为了避免在同一时间过度使用氮肥，损害稻秧，氮肥施在三次：底肥（ 50 ） ，分蘖肥（ 30 ）和穗肥（ 20 ） 。磷，钾肥分别为基肥施一次。幼苗生长在绝缘和干燥的土壤养分（苗特有的土壤，根据生长方式和水稻幼苗的营养特点准备） 。稻苗在4叶期移栽到准备好的塑料盆中。每盆有3个孔，每个孔有1幼苗，每个样品重复3次。植物覆盖避雨，以防雨水和氮肥的损失。其他管理人员均同于一般的生产领域。剑叶收集在抽穗期，液氮速冻 ，并储存于-80 ，以备使用。相对叶绿素含量，叶片含氮量的测量使用叶绿素含量计（CCM-200，OPTI-科学，美国）对在抽穗期剑叶中主茎的相对叶绿素含量进行了测量。在每个盆中收集三片叶子，分别测定每片叶子的上部，中部和下部。每个处理重复3次。将抽穗期的剑叶分别放在在105C烘箱中固定30分钟，在80干燥至恒重，然后研磨。半克样品（精确至0.0002g克）置于消化管和浸在1毫升水中。硫酸钾（7克）和硫酸铜5H2O（0.8 G）加入在消化管与催化剂12毫升的浓硫酸，并充分混合。样品被消化的消化烘箱中于420维持60-90分钟，直到溶液变得透明的蓝绿色的颜色。冷却10-20分钟后，叶片含氮量是用一个自由和开放源码的Kjeltec2300分析仪组（福斯AB，瑞典）测定。提取和纯化的总RNA 按照Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）的说明提取RNA和使用RNeasy mini试剂盒（Qiagen公司，荷兰）进行RNA的纯化。纯化的RNA样品A260and A280值是使用UV分光光度计（日立公司，日本）进行测定。根据测得的浓度，每个RNA样品稀释到相同浓度下，和1 g RNA是由0.8变性琼脂糖凝胶电泳检测到。RNA样品从3生物重复进行等体积混合，并用于微阵列分析。水稻基因芯片由中国康辰生物科技公司，采用含有43 803探头安捷伦微阵列芯片进行全球表达谱分析。每个样品用Cy3荧光标记。 cDNA合成，芯片杂交，洗涤，扫描。是按照2008年版的用户手册（ http:/www.chem.agilent.com/Library/usermanuals ）执行。使用安捷伦图像解析软件的微阵列数据进行了分析。扫描后获得的大量微阵列数据。首先被归一化每一个阵列的原始数据来设置每个阵列为0的平均表达值和背景的调整，以增加信噪比。多余数据，进行删除，以提高加工效率和使结果更容易理解。这两个品种的N1处理作为对照，通过N0处理并对表达水平进行了比较，表达水平超过2倍的变化被认为是基因表达改变的阈值。实时定量PCR分析将每一RNA样本三个重复反转录成cDNA，然后进行实时定量PCR分析，将反转录的cDNA作为模板，使用来自Qiagen公司在ABI7500荧光定量PCR仪中的SYBR Green RT-PCR检测试剂盒中水稻肌动蛋白作为内部参考。在超级绿色水稻SN196微阵列分析中有四个基因的差异表达中随机选取，使用设计的引物表达3.0软件（表1） ，以验证基因芯片分析结果的引物进行实时荧光定量PCR分析。从每个样品中每个基因重复四次并用相对定量法进行定量计算。计算公式为靶基因的相对定量是相对。 EXP = 2 - Ct法，其中Ct法= Ctunknown样品 - Ctcalibrator ， Ctunknown样品= Ctinternal参照基因 - Cttarget基因， Ctcalibrator = Ctreference基因的参考样本 - Cttarget基因的参考样本.结果：表1中。引物为肌动蛋白的实时定量PCR和四个随机选择的基因的差异表达在超级稻绿SN196微阵列分析。1.在低氮胁迫水稻剑叶叶绿素和氮含量 表二表明，在低氮胁迫下这两个品种中相对叶绿素含量和氮含量较对照水平下都明显降低， SN196和 Toyonishiki中相对叶绿素含量分别降低22%和41%达到显著水平，而相对氮含量分别降低21%和41%也达到显著水平。通过这两个品种之间比较，超绿SN196剑叶中叶绿素和氮含量明显高于Toyonishiki。2. 低氮胁迫下水稻剑叶相对转录因子基因 与对照组相比，在低氮胁迫下SN196剑叶中有53个转录因子的表达发生了变化，其中，35个基因下调,3.6倍的变化，18个基因上调，2.8倍的变化。Toyonishiki剑叶中有27个转录因子的表达发生了变化。其中21个基因下调在2.0-5.4倍之间平均2.7。6个基因上调在2。3到13.6倍之间，平均4.2倍的升高。3. 低氮胁迫下在水稻不同叶绿素含量的品种特异性反应和重叠的转录因子基因在低氮胁迫下，水稻不同叶绿素含量的最低氮肥胁迫响应转录因子曾在转录水平发生特异性改变。在SN196剑叶中的53个低氮肥胁迫响应转录因子中48个发生特异性改变，达到90.6%.在这48个中，17个上调，31个下调到转录水平。Toyonishiki剑叶中的22个低氮肥胁迫响应转录因子发生特异性改变，达到78.6%.在这22个中，有17个转录抑制其中5个是在低氮胁迫下。在低氮胁迫下在SN196和Toyonishiki有含有5个相同的低氮胁迫响应转录因子，其中4个表达下调1个上调。4. 低氮胁迫响应转录因子和其他一些转录因子的分类 表4和5中表明，低氮胁迫下含有高叶绿素的SN196转录过程中有53个转录因子发生变化。他们属于14转录因子家族。MYB家族含有最多的上调转录因子，其中Os07g0443500达到最高上调水平。WRKY家族含有最多下调转录因子，其中AK106282达到最高下调水平。有一些家族同时含有上调和下调转录因子。例如bHLH家族中当其他基因下调的时候AK073183上调。WRKY家族中当其他基因下调的时候AK109770上调。MYB同时含有上调和下调基因。在Toyonishiki中有8个转录因子家族的转录因子表达发生变化。MYB中的Os07g0443500达到最高上调水平 bHLH和MYB家族同时含有上调和下调基因。5. 低氮胁迫响应转录因子中染色体分布 在SN196中低氮胁迫响应转录因子主要分布在1,2,3,4,5,6和第8条染色体上，第3条染色体上含有最多的低氮胁迫响应转录因子基因。第4条染色体上含有9个。在第2和7和11条染色体上仅含有一个转录因子。在第9,10,12条染色体上没有发现改变的转录因子。 在Toyonishiki中低氮胁迫响应转录因子主要分布在1,2，3条染色体上，主要的转录因子分布在第3条染色体上，（9个）属于4个转录因子家族。其次就是第1条染色体上（6个），他们属于2个转录因子家族。在第8和第10条染色体上没有转录因子表达的变化。在这两个品种有四个相同的转录因子表达量降低，3个在第3条染色体上，一个在第11条染色体上。在这两个品种中有一个相同的转录因子表达量升高。在第7条染色体上。6. 实时定量PCR分析为了验证微阵列数据的准确性，在SN196中表达变化的基因中随机选择4个，设计引物进行实时定量PCR分析，PCR反应后，对熔解曲线进行分析。溶解曲线呈单峰，表明每一个PCR产物要有优异的特异性来保证后续结果的可靠性。表明，通过实时定量PCR分析基因1和基因2的表达变化倍数略高于微阵列分析。在基因3和基因4中实时定量PCR分析的表达变化倍数略低于微阵列分析。从这四个表达变化的基因，实时荧光定量分析的结果基本上是与该微阵列分析结果基本一致，表明该微阵列分析是可靠的。讨论转录因子在植物抗逆中起着重要的作用。在不同的胁迫条件下，许多转录因子的转录水平例如AP2/EREBP, bZIP/HD-ZIP和 MYB既能诱导又能抑制。特异性转录