珠海联邦制药股份有限公司马来酸曲美布丁片的微生物限度的检查方法 马来酸曲美布丁为 3,4,5-三甲氧基苯甲酸(2-二甲氨基,2-苯基)丁酯的马来酸盐,在水中微溶,制成的片剂在微生物限度检查中,由于溶解度小,培养过程中 马来酸曲美布丁在培养基内或表面析出,形成放线状或梭状的结晶,影响细菌和霉菌的观察和计数。为此我们参照中国药典1995年版附录微生物限度检查法和卫生部药品卫生检验方法,以吐温-80作为稳定剂和助溶剂,并适当扩大稀释倍数以增加溶解度,防止马来酸曲美布丁的析出;即用含不同浓度吐温-80的生理盐水和磷酸盐缓冲液制备成1：20的供试液,进行析出结晶和微生物检出试验;结果表明磷酸盐缓冲液中加入少量吐温-80能较好的阻止马来酸曲美布丁的结晶析出,且不影响微生物的检出。现将试验报告如下：1、试验材料： 11样品 马来酸曲美布丁（海南普利制药厂）马来酸曲美布丁片（海南普利制药厂，批号 980610，980611，980612）马来酸曲美布丁片（舒丽启能，天津田边制药有限公司 批号 9802001）12试剂 氯化钠， 磷酸二氢钾，氢氧化钠,吐温-80 （均为分析纯）营养琼脂培养基，营养肉汤培养基，虎红琼脂培养基,甘露醇高盐琼脂培养基,麦康凯琼脂培养基（中国药品生物制品检定所）金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003 ，大肠杆菌CMCC（B）4410313 金黄色葡萄球菌及大肠杆菌菌液的制备：取一环金黄色葡萄球菌（大肠杆菌）菌苔置100ml营养肉汤培养基中，35培养18小时后，即得。临用时，取1ml菌液用生理盐水稀释成每1ml中含活菌为50-100个/ml,作为供试菌液。2、试验方法21 对照稀释液灭菌的0.9%生理盐水溶液(以下简称生理盐水)灭菌的磷酸盐缓冲液（pH7.2以下简称缓冲液）试验稀释液100ml 含30ml吐温-80和10ml液体石腊的无菌生理盐水 含1%吐温-80的无菌生理盐水 含5%吐温-80的无菌生理盐水 含10%吐温-80的无菌生理盐水 含1%吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液 含5%吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液 含10%吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液 含20%吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液 供试液的制备 分别取马来酸曲美布丁原料（或片剂研磨后的粉末），分别加对照稀释液或上述各种稀释液各100ml，分别制成1：20的溶液，备用。检查方法 按中国药典1995年版附录微生物限度检查法、马来酸曲美布丁结晶析出试验 取用对照稀释液制成的供试液，按中国药典1995年版附录微生物限度检查法中的细菌总数的常规检查法进行试验，结果培养3-4小时开始在细菌和霉菌培养基表面有少量放线状物产生，继续培养16-18小时在上述培养基内或表面均有大小不等的放线状物或梭状物产生，取细菌培养皿内的放线状物或梭状物进行以下试验。 311 取上述放线状物或梭状物，接种至另一备妥的营养琼脂培养基平板上，培养18小时后，均无微生物生长。 用革兰氏染色法染色，镜检，均末发现有类微生物的形态。 3. 1. 3在显微镜下检视为放线状,树枝状或梭状的结晶（图1），与供试品的上清液置载玻片上自然风干后在显微镜下观察的结晶一致（图2）。图1 4.1抑制结晶析出试验 图2取2.3 项下的各供试液依法检查结果见下表1表1 马来酸曲美布丁结晶析出结果供试品原料制剂稀释液盐水盐水缓冲液细菌培养基霉菌培养基- 表示无结晶析出; + 表示有结晶析出;表示部分有结晶析出吐温-80 对微生物生长的影响 吐温-80本身可作为片剂的辅料,无抑菌作用;中国药典1995年版附录微生物限度检查法已用作增溶剂;但我们仍进行了微生物生长的比较试验。取缓冲液和稀释液（5）含1%吐温-80制成的马来酸曲美布丁1：20的供试液1ml分别置灭菌培养皿中，分别加入金黄色葡萄球菌菌液，大肠杆菌菌液1ml,按细菌总数的检查方法，用甘露醇高盐琼脂和麦康凯培养基培养18小时后，计数，结果（见表2，3）表明金黄色葡萄球菌，大肠杆菌的检出数是一致的，故认为1%吐温-80对微生物的检查无影响。表2 金黄色葡萄球菌的检出试验空白：0个 加入活菌数：118个/ml试验号平均缓冲液组（个ml）11211810712010198129106稀释液组（个ml）119102109117131104113107表3 大肠杆菌的检出试验空白：0个 加入活菌数：109个/ml试验号平均缓冲液组（个ml）110100109101103991001051034稀释液组（个ml）1021011001071101041131021055讨论：表1 的结果表明各稀释液中加入增溶剂吐温-80可抑制或部分抑制马来酸曲美布丁析出结晶。以生理盐水作为稀释液，吐温-80的浓度需达20%以上时，在细菌和霉菌培养基中，马来酸曲美布丁才不析出结晶；而以pH7.2的磷酸盐缓冲液中，各试验浓度的吐温-80供试液在两种培养基上均不析出结晶。我们分析缓冲液可能有助于马来酸曲美布丁溶解的稳定性，因此单用或含少量吐温-80即可抑制结晶的析出；而0.9%的生理盐水则不然。实验中我们发现单用缓冲液制备的供试液虽然在两种培养基中都末见马来酸曲美布丁结晶析出，但制成1：20的供试液混悬液不均匀，成絮状物，且易沉淀；而加入各浓度吐温-80的缓冲液制 成1：20的供试液中混悬均匀，粉末较细，不易沉淀。为了使马来酸曲美布丁能很好地分散在稀释液中，并使在培养过程中不析出结晶影响菌落数的检查，随着吐温-80浓度的增加,稀释剂的粘度也增加,故我们推荐选用含1-5%吐温-80的磷酸盐缓冲液作为本品的稀释液。表2，表3 的结果表明吐温-80对微生物的生长无影响，故可作为本品的增溶剂和稳定剂。 参考文献：1中华人民共和国药典 1995年版 二部 化学工业出版社 广东科技出版社2药品卫生检验方法 1990年版 中华人民共和国卫生部朱继清第 2 页 共 3页03-8-17