蛋白质离子交换层析技术【Major】 2009-04-02 14:47:45阅读19评论0 字号：大中小订阅摘要：本文介绍了离子交换的基本理论、影响分离纯化的因素、常见的 离子交换剂和树脂的处理，以及离子交换层析的基本操作方法。列举了 离子交换层析技术的一些最新应用。关键词：离子交换层析基本理论树脂处理操作方法应用进展Protein Ion Exchange Chromatography TechniqueAbstract: The basic theories of ion exchange, factors that can influence the separation and purification of proteins, common ion exchangers, ways of processing the resin and basic operating method of ion exchange chromatography are introduced. Some latest applications of this technique are enumerated.Keywords: Ion exchange chromatography; basic theories; resin processing; operating method; advancement of application近年来，随着基因工程和细胞融合技术的发展，利用细菌发酵和动植物 细胞培养表达蛋白质成为一种常规技术。和其它生物产品的生产过程一 样，蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是 运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行 处理、分离、纯化、加工目标产物。为了生产高纯度、高活性的生物制 品，生物工程技术研究经费的30%需花费在分离纯化工艺过程的研究 上，调查结果显示，利用传统的分离纯化技术纯化分离阶段的平均生产 费用占总生产成本的80%。在众多的蛋白质分离纯化技术中，层析是一门关键技术，它通常在分离 工序的后部，决定着产品的纯度和收率。和其它分离技术相比，层析技术 具有分离效率高、适用性广和过程易于放大、易于自动化的特点，因而 得到了广泛的应用1。本文将对其中的离子交换层析技术作详细介绍。1基本理论1.1离子交换的概念离子交换是利用各带电粒子与离子交换剂之间结合理的差异进行物质 分离的操作方法。1.2离子交换的原理氨基酸、蛋白质、核酸等大多是两性物质，在水溶液中带有电荷。由于 生物分子自身的性质差异，造成了在特定的介质中所带的电荷种类和密 度不同，这就是离子交换的理论依据。离子交换现象可用下面的方程式表示：阳离子交换反应：Resin-S03H + Na+ = Resin-S03 Na + H+33Resin-SO3Na + H+ = Resin-SO3 H + Na+33阴离子交换反应:Resin-N(CH3) 30H + Cl- = N(CH3) 3 Cl + OH-3333图 1 离子交换过程的机理A+自溶液中扩散到树脂表面A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心A+与RB在活性中心上发生复分解反应解吸附离子B+自树脂内部扩散至树脂表面B+离子从树脂表面扩散到溶液中交换速度的控制步骤是扩散速度，不同的分离体系可能由内部扩散或外部扩散控制Resin-N(CH3) 3 Cl + OH- = N(CH3) 3 0H + Cl-33331.3离子交换的分类1.3.1分类按活性基团分类，可分为阳离子交换树脂(cation exchange)(含酸性基 团)和阴离子交换树脂(anion exchange)(含碱性基团)。具体又可以 分为：强阳、弱阳和强阴、弱阴。(1)强酸性阳离子交换剂：活性基团是so3h (磺酸基)和-ch2so3h(次甲基磺酸基)；(2) 弱酸性阳离子交换剂 活性基团有-COOH -0CH2C00H C6H5OH265等弱酸性基团；(3) 强碱性阴离子交换剂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲 基-B-羟基乙基胺基；(4) 弱碱性阴离子交换剂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围 宽，而弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范 围小。1.3.2常见离子交换树脂的鉴定在树枝的使用过程中，由于保管不善或其他的偶然因素，即将树脂搞 混。而各类树脂的形状和颜色又无统一的规定，故单从外观很难识别阴 阳。彦文斌等建立了简便的方法，利用CuSO4、HCI、NaOH、NH3.H2O、 酚酞和甲基红等试剂鉴定四类常见树脂2。(见图2)图2常见离子交换树脂的鉴定1.4常用的离子交换剂 1.4.1离子交换树脂 离子交换树脂是一种在交联聚合物结构中含有离子交换基团的功能高 分子材料。离子交换树脂不溶于酸、碱溶液及各种有机溶剂，结构上属 于既不溶解、也不熔融的多孔性固体高分子物质。每个树脂颗粒都由交 联的具有三维空间立体结构的网络骨架构成，在骨架上连接着许多较为 活泼的功能基。这种功能基能离解出离子，可以与周围外边离子相互交 换。离子交换树脂的单元结构由三部分组成:不溶性的三维空间网状骨 架、连接在骨架上的功能基团和功能基团所带的相反电荷的可交换离子 3。1.4.2离子交换纤维素离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状 结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如 蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换 和洗脱条件温和、分辨率高常用的离子交换纤维素有：甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素CMC）、 二乙基氨基乙基纤维素（DEAE）1.4.3离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空 间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物，如sepharose、sephadex。 特点：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的 效率。目前，商品化的离子交换层析介质品种很多4。1.5影响交换速度的因素离子交换速度的影响因素很多，综合起来主要有以下几个方面：(1) 颗粒大小：愈小越快(2) 交联度：交联度小，交换速度快(3) 温度：越高越快(4) 离子化合价：化合价与高，交换越快(5) 离子大小：越小越快(6) 搅拌速度：在一定程度上，越大越快(7) 溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越 快1.6影响离子交换选择性的因素(1) 水合离子半径：半径越小，亲和力越大；(2) 离子化合价：高价离子易于被吸附；(3) 溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容 量;（4）离子强度：越低越好;（5）有机溶剂：不利于吸附；（6）交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大; 交联度小，膨胀度大，吸附量减少；（7）树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等 辅助力；2离子交换剂的处理、再生和转型2.1处理由于新树脂在生产和运输途中会引入一些中间体和一些杂质，所以应用 前要处理。首先要去杂、过筛，粒度过大时可稍加粉碎，对于粉碎后或 粒度不均匀的树脂应进行筛选和浮选处理，以保证树脂粒度均匀。用蒸 馏水、乙醇浸泡（去除残存的少量有机杂质）后,再用约1mol/L的NaOH 和1mol/L的HCI反复冲洗。可用十倍树脂量的液体，各3次，每次酸和 碱处理转换时用水洗至中性，最后用水洗至中性，经缓冲液平衡后即可 使用或装柱5。2.2再生树脂可以重复使用，使用其吸附有效成分后，将有效成分洗脱下来，可以 再利用，需要用酸碱转型,用水洗至中性，但是用的次数多了，会有一些杂 质在上面影响效率，需要彻底再生或换新树脂，一般树脂可以使用20次 以上。再生方法:用氢氧化钠处理、浸泡（阴树脂），或用盐酸处理、浸泡（阳 树脂），也可以用饱和盐水浸泡。动态再生方法比一般再生方法优越。被 铁离子污染的阴离子交换树脂用亚硫酸钠去除较彻底。近年，清华大学报道了利用水代替酸碱作为再生剂再生失效离子交换树 脂的体外电再生工艺，使离子交换水处理变为一种绿色环保水处理技术 。2.3转型转型是为了发挥树脂的交换性能，按照使用要求人为地赋予平衡离子的 过程。对于弱酸或弱碱型树脂须用碱（NaOH）或酸（HCI）转型，对 于强酸或强碱型树脂除使用酸碱外还可以用相应的盐溶液转型。总之，对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，即要求其带 上使用时所期望的离子或基团。3离子交换层析基本操作方法3.1树脂的选择选择离子交换树脂的主要依据是被分离物质的性质和分离目的。最重要 的一条是根据分离要求和分离环境保证分离目的物与主要杂质对树脂 的吸附力有足够的差异。一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离，碱 性物质用阳离子交换剂分离，氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质， 可根据其pl值及离子化曲线来选择。当目的具有较强的碱性或酸性时，宜选用弱酸或弱碱性的树脂 这样有 助于提高选择性并便于洗脱。如目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物 质，往往选用强碱或强酸树脂。对于大多数蛋白质、酶和其他生物大分 子的分离多采用弱酸或弱碱性树脂，以减少生物大分子的变性，有利于 洗脱，并提咼选择性。3.2层析柱离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的 层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1： 101： 50之 间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。3.3装柱先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵，赶尽气泡并把柱子垂直 固定；将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均 匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶 23cm为宜。3.4平衡缓冲液 平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓 冲液的离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的 稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量 使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分 离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结 合或结合不稳定。3.5上样离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不 宜过大，一般为柱床体积的1%-5%（体积分数）为宜，以使样品能吸附在 层析柱的上层，得到较好的分离效果。将柱中的缓冲液逐渐放出，使顶 部液面达到近于柱床面时开始加样。用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环 加入酶样，待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。待样母刚好全部 进入床内后用足够量的起始缓冲液流过层析柱，洗出未被吸附的物质。3.6洗脱缓冲液在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH 值两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从 而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH值的洗脱， 对于阳离子交换剂一般是pH值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是 pH值从高到低。由于pH值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一 般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。3.7洗脱速度洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果洗脱速度通常要保持恒 定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分 离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实 际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠， 则应适当缩小梯度范围或降