T/CSTM007452022/T/CAIA/SH0182022引言本文的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到1条与6.1超临界流体色谱反相液相色谱联用系统（SFC-RPLC）相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人姓名：岛津企业管理（中国）有限公司地址：中国上海市上海自由贸易试验区富特西一路381号汤臣园区A1楼第6层B部位请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。2T/CSTM007452022/T/CAIA/SH0182022植物油苯并(a)芘测定超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱法重要提示：使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本文件规定了使用超临界流体色谱在线净化-反相高效液相色谱法测定植物油中苯并(a)芘的方法。本文件适用于植物油中质量分数为0.5g/kg50g/kg的苯并(a)芘的测定。注：本文件规定的范围是经过实验室间共同试验验证过的，通过改变试料量可能能够扩大测定范围。一旦扩展了测定范围，实验室应采用实验手段加以确认。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T5524动植物油脂扦样GB/T66822008分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1超临界流体supercriticalfluidSCF处于临界温度和临界压力以上的流体。3.2超临界流体色谱法supercriticalfluidchromatographySFC以超临界流体作为流动相的一种色谱方法。4原理3T/CSTM007452022/T/CAIA/SH0182022试料经正己烷溶解后，使用超临界流体色谱（SFC）-反相液相色谱（RPLC）二维系统对该溶液进行在线超临界流体色谱分离净化后，用中心切割的方式将苯并(a)芘导入到第二维的反相高效液相色谱系统进行分离，荧光检测器检测，外标法定量。5试剂或材料5.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为色谱纯的试剂和GB/T6682-2008规定的一级水。5.2正己烷。5.3异丙醇。5.4甲醇。5.5乙腈。5.6甲苯。5.7液体二氧化碳纯度99.99%（质量分数）。警示：苯并(a)芘是一种已知致癌物质，所有相关工作均应在通风橱中进行，佩戴手套以减少暴露。5.8苯并(a)芘标准储备液，100g/mL称取1.0mg苯并(a)芘标准品（纯度不低于99.0%（质量分数），精确到0.01mg。置于10mL容量瓶中，用甲苯（见5.6）溶解，定容。避光保存在05冰箱中，保存期1年。5.9苯并(a)芘标准中间液，1.0g/mL移取0.1mL苯并(a)芘标准储备液（见5.8），用乙腈（见5.5）定容到10mL。避光保存在05冰箱中，保存期1个月。5.10苯并(a)芘标准工作液将苯并(a)芘标准中间液（见5.9）用异丙醇（见5.3）稀释，得到浓度分别为0.05ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL的校准曲线溶液，用时现配。6仪器设备6.1超临界流体色谱反相液相色谱联用系统（SFC-RPLC）配有高压两位六通阀和荧光检测器，或性能相当者。超临界流体色谱在线净化系统配置图和工作原理参见附录A中图A.1和图A.2。6.2涡旋振荡器转速不低于1000rpm。6.3分析天平4T/CSTM007452022/T/CAIA/SH0182022感量为0.01mg和1mg。6.4玻璃具塞刻度试管10mL。6.5玻璃样品瓶约1mL，配有可密封的盖子。7样品按照GB/T5524的规定扦样。在采样过程中，注意防止样品污染。8试验步骤8.1试液制备称取1.00g样品，精确到0.001g。将试料置于10mL玻璃具塞刻度试管（见6.4）中，加入正己烷（见5.2）定容。用涡旋振荡器（见6.2）振荡1min，混匀，转移至1mL玻璃样品瓶（见6.5），待测。8.2推荐的仪器条件推荐的仪器条件如下：a)SFC色谱净化柱：二醇基柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5m，或性能相当者；b)预处理柱：C18柱，柱长50mm，内径4.6mm，粒径5m，或性能相当者；c)分析色谱柱：C18柱，柱长150mm，内径2.1mm，粒径5m，或性能相当者；d)柱温：40C；e)SFC流动相组成、梯度洗脱、阀切换参考条件见附录A；f)分析流动相组成：乙腈水混合溶液（体积比：9:1）；g)分析流动相流速：1mL/min；h)洗针液：异丙醇；i)进样量：20 mL；j)荧光检测器：激发波长384nm，发射波长406nm；k)室温：控制在18C30C范围内。8.3校准曲线的绘制将苯并(a)芘标准工作液（见5.10）分别注入系统，测定相应色谱峰。以标准系列工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到校准曲线回归方程，苯并(a)芘标准溶液的液相色谱图，见附录B。8.4试样溶液的测定将待测试液（见8.1）进样测定，得到苯并(a)芘色谱峰面积。根据校准曲线回归方程，计算试液中苯并(a)芘的浓度。9试验数据处理5苯并(a)芘含量g/kg重复性限r再现性限R0.550lgr=0.7190lgw-0.7452lgR=0.7249lgw-0.2695注：w为测量结果的平均值。T/CSTM007452022/T/CAIA/SH0182022试样中苯并(a)芘的含量按式（1）计算：.(1)式中：试样中苯并(a)芘含量，单位为微克每千克（g/kg）；r由校准曲线得到的试液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V试液定容体积，单位为毫升（mL）；m样品质量，单位为克（g）；1000分别为ng到g和g到kg的转换因子。试验结果保留到小数点后一位。10精密度本文件的精密度已通过试验验证，精密度原始数据见附录C。苯并(a)芘含量与试验结果的重复性限（r）和再现性限（R）间呈对数关系，见表1。表1精密度在重复性条件下，获得的两次独立测量结果的绝对差值应不大于重复性限r，以大于重复性限r的情况不超过5%为前提。在再现性条件下，获得的两次独立测量结果的绝对差值应不大于再现性R，以大于再现性限R的情况不超过5%为前提。11质量控制建立校准曲线后，应用质控样品确认校准曲线的有效性。在样品测定过程中，每隔一段时间应注入校准溶液或质控样品进行检查，如测定值与标准值的差值超过测定平均值的10%（使用质控样品应考虑不确定度），重新绘制校准曲线。校准溶液或质控样品的浓度以限量值或被测物附近的浓度为宜。12试验报告试验报告至少应给出以下几个方面的内容：a）识别样品、实验室和试验日期所需的全部资料；b）引用文件号；c）结果及其表示；6T/CSTM007452022/T/CAIA/SH0182022d）测定中发现的异常现象；e）对结果可能已产生影响的本文件中未作规定的各种操作或任选的操作。13其他本方法检出限应不大于0.2g/kg，定量限应不大于0.5g/kg。7T/CSTM007452022/T/CAIA/SH0182022附录A（资料性）超临界流体色谱反相液相色谱联用系统（SFC-RPLC）配置和流动相条件A.1SFC-RPLC系统及工作原理使用高压切换六通阀将超临界流体色谱（SFC）与液相色谱（LC）联用，配合荧光检测器，进行植物油样品的在线净化和其中苯并(a)芘的检测定量。超临界流体色谱在线净化系统配置图参见图A.1。A.2样品分析样品分析主要分以下三步：a)当六通阀处于图A.2a）所示位置时，Diol柱通过六通阀直接和背压控制器BPR连接，正己烷稀释后的植物油样品通过自动进样器注入，在超临界二氧化碳流体和夹带剂甲醇的共同作用下，弱极性的苯并(a)芘被保留在Diol柱上，非极性的脂质被优先洗脱下来，通过BPR流入废液；b)在苯并(a)芘即将从Diol柱中溶出时，六通阀的位置切换至图A.2b）所示位置。此时，Diol柱通过六通阀与C18预处理柱串联后，进一步和BPR进行连接。使用甲醇将苯并(a)芘从Diol柱中洗脱下来，进入到C18预处理柱中并被保留。在这个过程中，系统中的超临界二氧化碳流体被优先洗脱到废液当中。c)在苯并(a)芘即将从C18预处理柱中溶出时，六通阀切换至图A.2c）所示位置。此时，C18预处理柱和C18分析柱串联，在第二维分析流动相的作用下，苯并(a)芘从预处理小柱进入到分析柱中，与杂质进行分离后，使用荧光检测器检测。图A.1SFC-RPLC系统配置图8T/CSTM007452022/T/CAIA/SH0182022a)