实验二 武陵山野生食用菌母种的制作与培养一.目的1.了解食用菌菌种的来源，菌种的分离方法。2.掌握PDA培养基的配制、分装、灭菌的方法和食用菌菌种的培养方法。 3.熟悉和掌握无菌操作的原理和操作方法。二.原理首先是制作菌种，即通过孢子或组织分离出菌丝体，菌丝体扩大繁殖成为生产菌种；其次是将菌种接种于基质中，生产出食用菌的子实体。食用菌菌种是食用菌菌种生产和科研工作的基本材料。食用菌生产的菌种来源于野生食用菌资源，我国丰富的食用菌资源为我国食用菌产业的发展奠定了坚实的基础。食用菌菌种的最初来源是来自于野生食用菌资源，采用孢子或组织分离法分离得到食用菌菌种，然后把该菌种进行人工驯化、菌种选育，得到具有生产价值的食用菌菌种。母种是食用菌生产的经菌丝体，菌丝体扩大繁殖成为生产菌种；而该过程必须在无菌环境中以无菌操作进行，以防杂菌污染。一般在接种箱，无菌室或超净工作台上进行接种。接种前要对环境进行消毒，一般是用37%40%甲醛溶液于接种前按5ml/m3 的量熏蒸半小时。也可用紫外灯照射半小时，以杀死空气中的微生物。适合食用菌生长繁殖的混合培养料称培养基，由于不同的食用菌生长繁殖需要相应的营养条件及适宜的酸碱度。因此，在配制培养基时，还要根据所使用的配方，按次序配制培养基，并调节pH等。在液体培养基中加入琼脂等凝固剂后，就可制成试管斜面或在培养皿内倒成平板，成为用途广泛的食用菌母种培养基。三.实验材料 1.野生食用菌标本。2.量筒、试管、玻棒、铝锅、电炉、天平、高压灭菌锅、超净工作台、接种钩、酒精灯、火柴、蒸发皿、甲醛、高锰酸钾、70%酒精、无菌平皿3.培养基配方 （1）PDA培养基 马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂1825g 和水1000ml （2）完全培养基 蛋白胨2.0g、酵母膏2.0g、葡萄糖20g 、MgSO4H2O 0.5g、K2HPO4 1.0g、KH2PO4 1.0g、琼脂20g、水1000ml四.方法与步骤（一）培养基的配制1.把马铃薯洗干净，去皮，挖掉芽眼，切成大约1cm3 的小方块，在天平上称取200g。 2.把切好的马铃薯小块倒入铝锅中，加水1000ml，煮沸1530min。 3.用纱布（23层）过滤。 4.滤液加水至1000ml，加入蔗糖及琼脂。 5.加热使琼脂完全熔化。 6.趁热加入分装筒。分装于试管中（装量为1/5），塞棉花塞。 7.高压灭菌（121,30分钟）后，排成斜面。（二）菌种分离1.洗净手并用75%酒精消毒。 2.用75%酒精棉球对采集的野生食用菌子实体表面擦洗（消毒）。 3.用手术刀将食用菌子实体菌盖延菌柄方向切去多余部分，同时切去菌柄极处1cm左右，然后将经上述处理后的菌柄置于无菌培养皿处，用75%酒精浸泡12min。 4.用无菌镊子夹住子实体用无菌水冲洗45次，重复3.4操作一次。 5.将手术刀， 镊子（夹住菌柄）在火焰上灼烧，灭菌冷却。 6.用镊子夹住菌柄，将菌柄切下1cm小段，然后将小段切成长方体，灼烧冷却，进一步切成绿豆大小的方块。 7.灭菌接种针接种。 （三）菌种培养食用菌母种培养一般放在培养箱中，温度控制视所用菌种而定。一般平菇以2225为宜。五.高压锅的使用方法 高压锅的使用方法 （1）将待灭菌的物品（如：试管）放在灭菌筒内，包与包之间应留有适当的空隙，以利蒸汽流畅，达到彻底灭菌。 （2）盖上软管插入灭菌桶的槽内，上下对齐，对角拧紧螺栓，切勿漏气。 （3）加热。水沸腾之后，排尽锅内空气（当压力表的指针指到0.51kg/cm2）时，打开放气阀放气，进行两次放气阀，升压。 （4）待压力达到要求时，保持稳定，并开始计算时间。 （5）达到规定的灭菌时间后，关闭电源，让其自然降压冷却。 （6）待压力完全降到“0”后，松动对角螺栓，取下盖子，从灭菌桶内取出材料。 （7）若灭菌物为试管，则应立即放入特制的木箱内排成斜面。 （8）若灭菌锅用毕后，应把锅内的水倒掉，以免日久腐蚀。六.作业 P396 1，2，3