硫酸双氢链霉素工艺设计摘要近十年来，我国链霉素的年产量一直维持在 1000 吨以上，在 1993 年以前 国内产量最大的是华北制药厂，年产量在 650 吨左右，其次是大连制药厂和山东 济宁抗生素厂，年产量均在 200250 吨左右。本文综述了链霉素的国内外制药公司的生产技术水平，发展趋势及工艺研 究、酶技术的应用。同时对链霉素工业生产的流程：主要是链霉素的发酵和分离 提纯方法及实际操作中的条件控制方法加以分析论述。关键词：链霉素 生产技术水平 发展趋势 发酵 分离提纯 条件控制 硫酸双氢链霉素前言链霉素（Streptomycin）是瓦克斯曼Waksman S.A.)于 1944 年从灰色链霉（Streptomyces,griseus）培养液中分离出来的一种碱性抗生素。链霉素是一种 相当强的有机碱，也是一种多糖类化合物。其分子结构是由链霉肌、链霉糖和 N-甲基-L-葡萄糖胺三部分以苷键相联结而成的。链霉素碱稳定性特别差，工业 产品主要是其硫酸盐形式， 即硫酸链霉素(Streptomycin Sulfate)。 链霉素对结核杆 菌有强大抗菌作用，其最低抑菌浓度(MIC)一般为 0.5 mg/L。它对许多革兰氏阴 性菌(G-)如大肠杆菌、肺炎杆菌、肠杆菌属、沙门菌属、布鲁菌属等也具抗菌作 用。链霉素对革兰氏阳性菌(G+)抗菌活性较差。链霉素游离碱为白色粉末。大多 数盐类也是白色粉末或结晶，无嗅，味微苦。链霉素在中性溶液中能以三价阳离 子形式存在，所以，可用离子交换法进行提取。其水溶液比较稳定，但其稳定性 受 PH 值和温度的影响较大。其硫酸盐的水溶液在 PH=4-7，室温下放置数星期， 仍很稳定，如在冰箱中保存三个月内活性无变化。 目前抗生素的生产主要是利用微生物发酵来进行，少数采用化学合成的方 法，当然也有的采用化学法或生化法半合成。对于链霉素可由灰色链霉菌发酵生 产。双氢链霉素可由湿链霉菌产生，但通常以半合成方法生产。 一般认为链霉素是治疗结核杆菌感染的首选药物，除此以外，还用于治疗革 兰氏阴性菌所引起的泌尿道感染、结核性脑膜炎，鼠疫，肠道感染，肺炎，败血 症，百日咳等。链毒素的缺点是容易产生耐药性；长期使用对第八对脑神经有毒 害除了医用外，也有报道将链霉素用于农牧业的。例我国新疆某生产建设兵团的 农场自 1985 年起应用链霉素治疗菜类瓜类和粮食等作物的病害， 取得较好效果； 链霉素还可用于猪肺炎， 雏鸡白痢疾、 以及鸡， 鸭， 鹅的巴氏杆菌感染等的治疗。 国内有些厂家将生产的链霉素作为农用出口，效益较好。第 1 章 国内外链霉素生产的研究概况1.1 国外生产及技术水平概况国外生产链霉素的有近二十个国家的约三十家制药公司。其中主要的公司 有美国的默克(Merek 公司，辉瑞(Pfizer)公司，施贵宝(Squibb)公司，英国的葛兰 素(Glaxo)公司比彻姆(Beecham)公司，德国的赫斯特(Hoeehst)公司，法国的罗 纳普朗克(RhonePoulene)公司，丹麦的挪佛(Novo)公司，日本的协和(Kyowa) 发酵株式会社等等。此外还有原苏联，荷兰、印度、保加利亚、西班牙等国家的 一些公司。 由于链霉索的耳毒性较严重，世界各国的产量和使用量呈逐年下降趋势。如 原苏联 1976 年链霉素的产量达 1415 吨，1987 年降为 600 吨，1989 年为 800 吨 左右。美国施贵宝公司和匈牙利的诺因工厂先后于 1977 年和 1980 年停产。目前 国外链霉素的主要生产企业是美国的辉瑞公司和法国的罗纳普朗克公司。目前 全世界链霉素产量估计在 2500 吨至 3000 吨左右。1. 2国内生产及技术水平概况链霉素是我国较早投入生产的抗生素之一。生产企业曾有十几家，包括杭 州药厂，扬州制药厂等。近几年仅剩华北制药厂等五家药厂生产。凭借不断的创 新进步和“质量文化”的传承，目前，华北制药厂链霉素年产年产 1200 吨， 占亚洲总产量 75%、世界 60%的绝对优势，华胜公司成为目前世界最大的链霉 素生产企业，产量居世界第一。1.2.1 产量及出口量近十年来，我国链霉素的年产量一直维持在 1000 吨以上，在 1993 年以前 国内产量最大的是华北制药厂，年产量在 650 吨左右，其次是大连制药厂和山东 济宁抗生素厂，年产量均在 200250 吨左右。1.2.2 生产技术水平国内链霉素生产水平近十年来提高不快。以发酵单位为例，1982 年在 1900021000u/ml 之间，而 1991 年全国平均水平也仅为 21715u/ml。国内水平最 高的是大连制药厂，1991 年发酵单位 22990u/m l，生产指数 0.6982 总收率最高 的是华北制药厂，1991 年达 79.55%1.2.3 产品质量目前国内所有链霉素生产企业都能达到出口标准，一般认为华北制药广与上海第四制药厂的质量相对较好。链霉素质最方面的共性问题是：成品色级达不 到新优级品标准，异常毒性偏高一生物效价偏低、澄明度不符合标准等。1. 3国内外技术水平比较和展望我国链霉素生产最居世界前列。生产技术指标中，发酵水平与英、美公司 比略显落后(英国葛兰素公司发酵单位 3000040000u/ml，但发酵周期比我国长 1 倍，提炼收率高于葛兰素公司，我国处于领先水平。 近几年链霉素工艺技术方面的研究主要有下列几方面：1.3.1 菌种研究主要有链霉素产生菌(Streptomyces grlseus)之质粒研究17。已经证明质粒 与链霉素的生物合成有关，并提出了该菌株质粒 DNA 复制的初步棋式。另外还 有原生质融合，质粒 DNA 转化、DNA 重组的研究等。1.3.2 发酵工艺研究链霉素 B(甘露糖链霉素)的抑制，据报道链霉素 B 的生物恬性仅为链霉素 的五分之一。一般用培养基中加入氯化钙，天门冬酰胺或者各氨酰胺抑制链霉素 B 的形成。 另外也有报道在培养基中加入赖氨酸阻提高链霉素的发酵单位发酵过 程的微机控制研究一除对罐温，罐压、pH，糖，氮，溶氧、二氧化碳进行在线 数据控制外，有的企业还进行连续脉冲补料的应用研究。1.3.3 提炼工艺研究自七十年代至今研究报道甚少。前苏联和东欧国家有一些离子交换动力学 等研究文章，如氯化钙复盐一离子交换工艺。我国的工艺比英国葛兰素公司的更 为简便，曾有印度公司对我国工艺有兴趣。国内有些厂家在进行高压反渗透膜分 离技术应用的研究，据悉可提高提炼总收率 0.951.3318。内压中空纤维膜 在链霉素发酵液除菌中的应用也显示了其优点：膜对菌体可 100%截留,过滤液澄 清,黏度低,杂质少,对硫酸链霉素发酵液可取代离心工艺。目前有些厂家在进行 Ultraflo 超滤膜的技术研究，虽然此工艺还未用于大规模的生产应用，但实验 证明：Ultraflo 超滤膜的应用，能大大提高链霉素预处理的收率，降低链霉素 的损失，减少产品在母液及其他废液中的损失，有利环境保护。1.3.4 酶技术的工艺研究据报道，限定量的磷酸盐能诱导链霉索的形成，并导致胞内磷酸醇酶和三 磷酸腺苷酶的形成。发酵 23d 后，胞外磷酸醑酶和蛋白酶亦在培养液中发现。 当这两种酶活性高时，链霉索单位也较高。 在菌种选育方面，DNA(RDNA)技术在链霉素菌种选育中也有发展。 DNA 重组就是在特定的核苷酸位点用限制性内切酶将一部分 DNA 从麻分子中 切下来然后再将不同的 DNA 连接在一起，新形成的杂交 DNA 再插入到宿主 微生物细胞中，在宿主细胞中杂交 DNA 就象宿主正常基因片段那样进行克隆化 (复制)，继而提高抗生素的产量。第2章链霉素生产的工艺流程2.1 生产菌种放线菌是与人类关系极为密切的一类微生物,它们广泛存在于不同的自然 生态环境中，很多抗生素和具有生物活性的次级代谢产物均来自放线菌,链霉菌 更是研究的最多的一类菌种。由于抗生素的滥用和使用不当,临床上耐药菌株不 断出现,甚至出现超级耐药菌,筛选抗耐药菌的新抗生素或者寻找传统抗生素的替 代品成为新的趋势。链霉菌的研究主要集中在链霉素及其改良抗生素。筛选能够 抑制耐药菌株的链霉菌是今后努力的方向5。 早期发现产链霉素的菌种是灰色链霉菌， 后来又找到了产链霉素或其它类 型链霉素族抗生素（如羟基链霉素、双氢链霉素）的菌种。如比基尼链霉素、灰 肉链霉素等。 灰色链霉菌除产生链霉素族抗生素外还产生其他族抗生素，如细菌的多肽 类抗生素和杀假丝菌素、 放线酮等物质。 放线酮对酵母和其它真菌有很强的作用， 但由于毒性大，不能用于治疗人或动物疾病。 根据链霉素生物合成途径及代谢调节机制，选育链霉素生产菌应从如下几 个方面着手2.1.2 出发菌株的选择出发菌株多采用灰色链霉菌（Streptomyces griseus） 、比基尼链霉菌和灰色 链霉菌等。灰色链霉菌的孢子梗直而短，不呈螺旋形，孢子数量很多，孢子乃断 裂而成，呈椭圆形，气生菌丝和孢子均呈白色，单菌落生长丰满，呈梅花型或馒头型，直径为 34mm，基质菌丝透明，在斜面背后产生淡色色素。2.1.2 切断支路代谢当初级代谢和次级代谢处于分路途径时，通过选育需要初级代谢产物的营 养缺陷菌株可使相应的次级代谢产物增加。据报道，采用诱变的方法获得 L-丙 氨酸缺陷株，或选育苏氨酸缺陷、芳香族氨基酸缺陷变株，对提高链霉素的产量 有一定的作用。2.1.3 解除自身的反馈调节(1) 选育抗链霉素突变株：链霉素本身也可能在链霉素合成中起反馈抑制 作用，它能够完全抑制链霉胍激酶。通过在培养基中逐步增加链霉素浓度来培养 产链霉素的菌株，就可以选出抗性菌株。结合诱变处理，已获得耐高浓度来培养 产链霉素的菌株，就可以选出抗性菌株。结合诱变处理，已经获得耐高浓度链霉 素的菌株，使链霉素的产量得到提高。 (2) 选育高浓度磷酸盐抗性突变株：由于高浓度无机磷对链霉素生物合成 有抑制作用，因此选育出耐高浓度磷酸盐的新菌种，也是选育高产单位菌种的一 个方向。 (3) 选育营养缺陷型的回复突变菌：一个突变株失去某种生化特征，经过 2 次突变能回复该特征。有人通过诱变获得了肌醇缺陷的回复突变株，其链霉素产 量提高了 5 倍。 (4) 选育结构类似物抗性突变株：由于某些氨基酸对链霉素生物合成中的 某些酶有阻遏作用，因此通过选育某些氨基酸，特别是含硫氨基酸的结构类似物 抗性突变株可使链霉素产量提高。据报道，选育乙硫氨酸、蛋氨酸氧肟酸盐、硒 代蛋氨酸、1,2,3-三唑、三氟蛋氨酸抗性突变株，均有助于链霉素产量的提高。2.1.4 增加前体物的合成(1)葡萄糖胺是生物合成链霉素的前体物质。有人采用诱变方法获得了细胞 内葡萄糖胺含量提高 3 倍的突变株，其链霉素产量比原菌株提高了一倍。 (2)精氨酸也是合成链霉素的前体物，增加菌体细胞精氨酸生物合成能力， 有利于链霉素产量的提高。 (3)脒基转移酶是链霉胍合成的关键酶。有人将脒基转移酶进行了克隆，结果细胞内脒基转移酶的量得以扩增，从而增加了链霉素的前体物链霉胍的积累， 造成链霉素产量的提高。 利用链霉素抗性基因突变筛选法获得高产菌株的几率较高，大约 8.5%左右 的链霉素抗性突变株是万古霉素产量获得提高的菌株。 最高产量较出发菌株效价 提高 1.7 倍7。 链霉菌产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系是抗生素科研领域 的一个研究热点。 将链霉素抗性筛选法结合传统紫外诱变方法筛选万古霉素突变 株，克服了诱变随机筛选的盲目性和不定向性，提高了工作效率，正突变率达到 8.5%。2. 2无菌空气的制备在抗生素的工业发酵中， 生产菌大多是好气菌， 要求连续通入大量无菌空气， 故无菌空气的质量标准是至关重要的。根据生产厂家的经验，如果空气系统除菌 失效，造成发酵染菌，其染菌率占总染菌的 20%以上，造成巨大的经济损失8。