第20章 细胞基因分离鉴定和原位杂交第一节 细胞DNA、RNA的分离鉴定技术一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase处理和纯化来提取DNA，可用于细胞凋亡中对所引起DNA断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍了有关DNA的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的DNA还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。(一)DNA提取方法：(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K至终浓度为0.51g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。(3)50水浴2小时，转入37水浴过夜，次日加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DNA断裂，约3分钟。 12000r/min离心15分钟（室温） (4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质 12000 r/min离心15分钟（室温）(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀 12000 r/min离心15分钟（室温）(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20放置1小时 12000 r/min离心15分钟（室温）(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37水浴消化1小时，消化污染的RNA。(10)加入蛋白酶K至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50水浴2小时，加入Nace至终浓度10mmol/L。(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20 1小时。(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4贮存。(二)DNA纯度检测及含量计算DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于1.75.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8OD260值为1的溶液大约含50g/mL DNA，故DNA的浓度(g/mL)=OD260值50mg/L稀释倍数。DNA总量(g)=DNA浓度(g/mL)总体积(mL)DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。二、培养细胞总RNA的提取及鉴定细胞中含有三类RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源，是蛋白质合成的场所,有特殊意义,不同的细胞所表达某种蛋白的mRNA的种类和产量是不同的，为了提高细胞转录的mRNA的种类和产量，通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。提取细胞总RNA的方法，常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞，我们在细胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法，但不纯，本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，可利于提取总RNA，也可从总RNA中提取mRNA，从而分析mRNA表达量，建立cDNA文库，以及对mRNA的调控和进行反义RNA研究。变性液：7mol/L盐酸胍，25m mol/L棕檬酸钠pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L -巯基乙醇。水平衡酚：在饱和酚中加入等体积DEPC处理的三蒸水(或新鲜无菌的三蒸水)混匀后去除水相，再重复处理二次即可。所用玻璃、塑料制品、金属器材可用0.1% DEPC水浸泡过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用180干烤6小时，以去除被污染的RNA酶。(一)总RNA的提取方法：1、消化收集细胞方法同前。2、向离心管中的细胞沉淀物中加1.5mL变性液，立即充分混匀。3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸钠PH4.0、以及0.05mL氯仿，剧烈振荡混匀30秒后，立即置冰上放置15分钟，4 12000r/min离心15分钟。4、取水相，加入等体积酚/氯仿(1:1)混匀，剧烈振荡10分钟，412000rpm离心15分钟。5、取水相，加入等体积氯仿，剧烈振荡10分钟，再同上离心，再如此反复抽提一次后取水相，加入等体积的预冷的异丙醇(或异戊醇)混匀，低温放置20分钟，再同上离心。6、取沉淀用70%预冷乙醇洗两次，干燥10分钟，溶于DEPC处理的三蒸水中以溶解RNA，分装,-20冻存。(二)总RNA的鉴定及含量计算1、RNA纯度及含量测定取少量提取的RNA，经紫外线扫描，吸收峰位于波长260nm处，RNA纯度为OD260/OD280=1.82。OD260值为1的RNA溶液约含有40g/mL，故RNA浓度(g/mL)=OD260值40g/mL稀释倍数。2、RNA分子量大小鉴定2.1 配液：(1)10MOPS电泳缓冲液配制将41.2g2-(N-玛琳代)丙磺碱，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS溶于800mL经DEPC处理的50mmol/L乙酸钠液中，用2mol/L NaoH调整pH至7.0，加入20mL经DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加经DEPC处理的水至总体积为1000mL过滤除菌，避光室温保存。(2)甲醛加样缓冲液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯青FF、 50%甘油2.2 操作步骤：(1)制平板胶：1.2%琼脂糖煮沸，冷却至60，加入10MOPS缓冲液及甲醛溶液，使三者的比例为3.5:1.1:1，或三者的终浓度分别为1.2%、1及10%，于室温放置30分钟或更长时间，使胶凝固。(2)在无菌离心管中混合下列液体。 RNA(最多30g) 4.5uL 10MOPS电泳缓冲液 1.0uL 甲醛 3.5uL 65温育15分钟，水浴冷却、离心(3)加入2ul DEPC处理的加样缓冲液上样，进行电泳，5V/cm电压，3小时直到溴酚兰至胶的中部，可用已知RNA标本作分子量标准品，如28srRNA或9S兔-球蛋白mRNA。(4)电泳完毕，取出凝胶，浸泡在溴化乙锭溶液中(终浓度0.5g/L)染色3045分钟，紫外透射仪观察分子量大小。第二节 核酸蛋白转移电泳及杂交一、DNA Southern Blot及杂交本技术可用于基因组DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品DNA内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移(固定)、特异性DNA片断的分子杂交及放射自显影。(一)样品DNA内切酶水解限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37 1小时内能将1g DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。1、配液：10限制性酶消化缓冲液 10buffer O无盐：100mmol/L Tris HCL pH7.4 1mg/mL BSA 100mmoL/L MgCL2 10mmol/L DTT(二硫苏糖醇) 10bnffer L低盐：缓冲液O 0.5mol/L Nacl 10bnffer H高盐：缓冲液O 1.0mol/L Nacl2、操作步骤：(1)将DNA(0.21.0g)溶液加入EP管中,并加入适量H2O总体积为18L，混匀。(2)加入2mL 10限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。(3)加12U限制性内切酶充分混合。(4)37温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使达到终浓度为10mmol/L终止反应。(6)消化后的DNA直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。(二)Southern Blot及杂交。将经电泳走在琼脂糖中的DNA变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的DNA。1、配液： (1)变性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH (2)中和溶液：200mL 20SSC 100mL 1mol/L HCL 100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。 (3)20SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaoH调pH至7.0加水至1000ml，高压消毒灭菌。 (4)预杂交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4 125mL 20SSC 25mL 100DenhardtS溶液 5mL 5mg/mL鱼精DNA 250mL 100%去离子甲酰胺 82.5mL H2O(总体积为500mL) (5)100DenhardtS液：10g聚蔗糖(Ficoll400) 10g聚乙烯吡咯烷硐 10g牛血清白蛋白(组分V) 加H2O至500ml2、操作步骤(如图20-1)： 图20-1 Southern Blot装置图(1)内切酶消化的DNA，总体积为50uL，加入10uL加样缓冲液进行12-24琼脂糖电泳。(2)用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像