壳聚糖海绵体的不同制备方法对人胎儿皮肤成纤维细胞相容性的影响生物医学工程学杂志 1999年第0期第16卷 有机生物材料组作者：马建标王红军何炳林单位：南开大学 高分子化学研究所 吸附分离功能高分子材料国家重点实验室，天津300071Different Preparation Methods of Chitosan Sponges and TheirCompatibility for Human Neofetus Dermal Fibrobalast1前言组织工程是当今生物医学领域最活跃的研究领域之一，其中重要的一个方面是通过细胞在生物降解材料构成的三维支架中培养以制备生物活性人工器官。生物降解材料的选择与成孔加工，对一项具体研究的成败起着关键作用。目前组织工程采用的支架材料有聚乙醇酸或聚乙丙交酯1、胶原蛋白2、胶原/粘多糖复合物3等。研究发现，聚乙醇酸或聚乙丙交酯用作支架材料，有时会造成非细菌性炎症，原因在于酸性降解产物的局部积蓄。来自动物的胶原存在免疫原性、病毒疾病的传染、降解速度过快等缺点，而且成本较高。壳聚糖及其衍生物来源丰富，成本低廉，而且生物相容性好，无毒性，可生物降解，并具有诱导皮肤等组织再生的功能，因而已经作为手术缝线和伤口敷料在医学领域获得应用。在此基础上，由其为主要原料制备海绵体状多孔支架材料，并采用人低月龄胎儿皮肤成纤维细胞进行细胞培养试验，以便为壳聚糖海绵体在皮肤、软骨、骨骼组织工程中应用奠定基础。2实验部分2.1壳聚糖海绵体的制备以壳聚糖为原料，分别采用溶剂致孔法，惰性气体致孔法、乳化致孔法溶盐致孔法、以及有机溶质致孔法，制备具有一定厚度和不同孔分布的多孔海绵体。2.2海绵体材料的表征采用平衡吸水法测定海绵体的吸湿性和保湿性。用扫描电镜观察表面结构与结构。以摇瓶法测定其体外水解与酶解性能。2.3细胞相容性评价将准备好的海绵体支架材料，灭菌消毒后置于培养板中，将人胎儿表皮成纤维细胞悬浮液(1.0105cell/ml)从材料上部均匀加入，并补加培养基(DMEM+10%FCS)至1 ml，置入37 5% CO2培养箱中培养，第34 d换1次液，培养4周。采用光镜观察，或固定处理后扫描电镜观察，同时切片照相。3结果与讨论3.1壳聚糖的亲水性用于组织工程支架材料的海绵体，其策水性能对于细胞营养物质的传质至关重要。从表1中可以看出，不同制备方法中壳聚糖的浓度、溶剂组成、气体分散程度、乳液中有机相含量、溶盐浓度、水溶性有机溶质的浓度等因素对吸湿性和保湿性有重要影响。一般而言，在海绵体制备时加入能够与壳聚糖发生缔合作用的物质，可以提高海绵体的吸湿性，而且在一定范围内加入量越大，提高海绵体的吸湿性越强。海绵体的保湿性主要与其孔结构有关，孔隙率高、孔径小而均匀时，保湿率较高；反之，则保湿性较差。表1不同方法制备的壳聚糖海绵体的亲水性制法方法描述吸湿性保湿性制法方法描述吸湿性保湿性溶剂致孔法1.6%壳聚糖/0.1 MHAc1.901.28溶盐致孔法1.5%溶盐致孔1.122%壳聚糖/0.1 MHAc4.252.663%溶盐致孔1.762%壳聚糖/0.5 MHAc7.092.426%溶盐致孔2.46气体致孔法600rpm搅拌通氮气4.002.83有机溶剂致孔法5%有机A溶剂致孔7.442.921200rpm搅拌通氮气3.471.9910%有机溶剂A致孔8.462.52乳液致孔法10%有机相致孔0.392%有机溶剂B致孔0.9750%有机相致孔1.538%有机溶剂B致孔2.373.2海绵体的形貌用扫描电镜观察不同方法制备的海绵体的形貌，可以发现海绵体的孔随制备方法不同而改变，壳聚糖浓度降低或/和致孔剂含量提高导致其海绵体的孔尺寸增大，也的均匀性却相应下降。3.3海绵体的体外降解性能在溶菌酶浓度为5 mg/ml的PBS缓冲溶液(pH7.4)中于37 测定各海绵体的体外降解性能，发现采用孔径较大的壳聚糖海绵体，20 h后的剩余重量为81.2%；用结构更加紧密的壳聚糖膜进行类似实验，20 h之后材料的剩余量为80%。说明材料对海绵体的易接近性对于降解至关重要，结构疏松的海绵体有利于材料降解。3.4海绵体孔结构对细胞附着、生长与分裂的影响采用低月龄胎儿皮肤成纤维细胞在各种海绵体内培养。结果发现，在壳聚糖海绵中细胞并不像在壳聚糖膜上二维培养中那样呈现正常的梭形单层生长，而是以球形状态生长，细胞通过细胞新产生的基质相互连接并与材料相连结，而且新产生的细胞也以球形出现。细胞的大小为16 m，比贴壁生长的成纤维细胞小许多(或纤维细胞完全展开尺寸一般为2030 m)。这可能是由于孔的存在及材料表面的凹凸不平使细胞并不能以完全展开的方式生长、分裂，而以收缩的方式存在。这些细胞多生长在材料深层部位尤其是在孔的底部，以及材料表面较平缓的位置。这是由于当细胞悬浮液转移至材料上的，细胞在其本身的重力及海绵体的微孔的作用下多向深层迁移。材料孔径的大小也会影响到细胞的生长，通过实验观察可以看出孔的范围在1545 m内细胞较易生长，这可能是在这个孔径的范围内细胞更容易相互连接。壳聚糖海绵体中进行细胞培养，可以很好地维持其原状，即使经历30 d仍然没有发生明显的收缩，但细胞已经逐渐进入至材料中，并组成新组织。而胶原海绵体在培养4周后，只剩下原来的1/3左右的大小，而很大一部分已被产生的细胞间基质所代替。可见，壳聚糖海绵体这种多孔性支架材料既具备了较好的细胞相容性，又因其缓慢降解性而更好地维持材料的形状并呈现出较好的强度。参考文献1Cooper ML et al. Biomaterials, 1991;122432Berthod F et al. Biomaterials, 1993;147493Yannas V et al. Science,1982; 215174