人肺癌细胞系A549中肿瘤干细胞样细胞的分离及鉴定闫秀萍，罗 虎，周向东（400038 重庆，第三军医大学西南医院呼吸内科）摘要目的 从人肺癌细胞系A549中分离并鉴定肺癌干细胞。方法 将A549细胞置于无血清条件培养基中培养， 形成细胞球，采用平皿克隆形成实验、MTT细胞增殖实验、RT-PCR、Western blot、免疫荧光技术，检测并比较A549 细胞和A549细胞球的增殖能力及干细胞相关标记的表达水平，鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性。结果利用无血清条 件培养基从A549细胞中分离出肿瘤干细胞样细胞；相比A549细胞，细胞球呈悬浮生长，增殖能力和克隆形成数目 高于贴壁细胞，且干细胞相关标记Sox2和Oct4表达水平明显提高。结论 运用无血清条件培养基可以从A549细胞 系中有效富集肺癌干细胞样细胞。关键词 肺癌；肿瘤干细胞；细胞球Isolation and identification of lung cancer stem cells from human lung cancer cell line A549Yan Xiuping, Luo Hu, Zhou Xiangdong (Department of Respiratory Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China)【Abstract】Objective To isolate and identify the lung cancer stem cells from the established human lung adenocarcinoma cell line A549. Methods The A549 cells were cultured in serum-free condition medium to form tumor spheres. Colony formation assay and MTT assay were used to observe the colony formation ability. RT-PCR, Western blot analysis, and immunofluorescent staining were performed to compare the expression levels of stem cell markers between A549 cells and A549 tumor sphere cells. Results The stem cells were isolated from A549 cells in serum-free condition medium and formed typical neurospheres. The results showed that the proliferation and self-renewal capacity of the A549 sphere cells was stronger than A549 cells. A549 sphere cells expressed higher levels of stem cell markers Sox2 and Oct4 than A549 adhere cells. Conclusion The serum-free condition culture effectively enrich cancer stem cells from human lung adenocarcinoma cell line A549.【Key words】lung cancer; cancer stem cells; tumor sphereSupported by the National Basic Research Program of China (973 Program, 2010CB529402). Corresponding author: Zhou Xiangdong, E-mail:xiangdongzhou126.com基金项目国家重点基础研究发展计划（973计划，2010CB529402）通信作者 周向东，E-mail:xiangdongzhou126.com近年来，肺癌发病率及病死率居高不下甚至呈 持续上升趋势，加之其恶性程度高、预后差，已经 成为各种癌症中导致死亡的首要病因，严重危害人 类健康1。尽管目前肺癌综合治疗方面取得了一定 进展，手术、化疗和放疗仍然是当前肺癌治疗的主 要手段，但临床研究证实，多数患者确诊肺癌时已 属中晚期而丧失手术机会，加之肺癌对放化疗的抵 抗性，肺癌的 5 年生存率也未见明显提高1。肿瘤干细胞理论的 出现为肿瘤治疗带来新的 希望。随着该理论的发展，越来越多的证据表明化 疗耐药跟肿瘤干细胞有关，且在肿瘤的发生、维持 及转移过程中发挥重要作用2-4。但肿瘤干细胞的分 离、纯化及鉴定等研究仍是目前肿瘤干细胞研究的 热点和难点。1997 年 Bonnet 等5首次发现了白血病 干细胞。随着研究的深入，人们陆续在脑肿瘤、乳腺 癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、肺癌等肿瘤 中发现并成功分离出肿瘤干细胞6-11。目前国内外有关肺癌干细胞的研究进展缓慢，原 因之一就在于公认的、高特异性的肺癌干细胞分选标 记尚未发现。本研究运用无血清条件培养基的悬浮培 养方法分离并富集肺癌干细胞，并且进一步鉴定细胞 球的肿瘤干细胞特性，为肺癌干细胞的分离、富集及 进一步研究奠定基础。1 材料与方法1.1 细胞株及主要试剂细胞株：人肺癌细胞株A549来自中国科学院上海生命科学院细胞库。主要试U：RPMI 1640培养基（Gibco公司），胎牛血清（FBS， Gibco公司），DMEM/F12培养基（Gibco公司），重组人表皮 生长因子（epidermal growth factor, EGF）、重组人碱性成纤 维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）均来自 PeproTech公司，B27 （Gibco公司），小鼠抗人Oct4单克隆 抗体（Abcam公司），小鼠抗人Sox2单克隆抗体（Novus 公司），Cy3标记的羊抗小鼠IgG（碧云天公司），Cy5标记 的羊抗兔IgG （碧云天公司），PVDF膜（Millipore公司）， 羊抗兔IgG （碧云天公司），小鼠抗人GAPDH单克隆抗体 （Invitrogen 公司）。1.2 细胞培养A549 细胞培养：培养基为含有 10%胎牛血清的 RPMI 1640培养基，在37C, 5% CO2培养箱内饱和湿度条件下培 养。实验取对数生长期的细胞。细胞球培养：培养基为DMEM/F12培养基，含有20卩 l/ml B27, 20 ng/ml EGF，20 ng/ml bFGF。将 A549 制成单细 胞悬液以20 000个/孔的密度种植6孔板中，每孔2 ml培养 液，每隔23 d半量换液。在37C，5% CO2条件下培养， 显微镜下观察细胞成球情况和形态。实验取第3代细胞球。 1.3 细胞增殖实验和克隆形成实验A549细胞及细胞球增值能力的检测，采用MTT法。将 A549细胞和A549细胞球制成单细胞悬液按1 X 104/孔的密度 分别加入96孔板，每孔200山，对照组只加培养基。在37C, 5% CO2条件下培养，每过24 h,拿出孔板检测，检测6 d,取 每次检测的平均值。检测时，力加180山基础培养基和MTT 20W （5 mg/ml）, 37C, 4 h,除去培养液,每孔加入150山DMSO, 摇晃10 min。酶标仪测定的光密度值D（490）,以光密度值和 时间为坐标绘制细胞生长曲线。将A549细胞和A549细胞球制成单细胞悬液按200个/ 孔的密度分别接种于6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛 血清的RPMI1640培养基，定期换液，在37C, 5% CO2条 件下培养2周，将培养基吸弃，用PBS润洗后加入4%多聚 甲醛固定，然后用结晶紫染色，观察克隆形成情况。1.4 RT-PCR 检测收集 A549 细胞和细胞球进行总 RNA 提取，用试剂盒 反转录为cDNA后进行RT-PCR,引物设计如下：Oct4上游： 5 -GCAGCGACTATGCACAACGA-3 ， 下 游 ：5 -CCAGAGTGGTGACGGAGACA-3 ； Sox2 上游： 5 -CATCACCCACAGCAAATGACA-3 ， 下 游 ：5 -CTCCTACCGTACCACTAGAACTT-3；GAPDH 上游： 5 -AGCCACATCGCTCAGACA-3 , 下 游 ：5 -GCCCAATACGACCAAATCC-3。引物合成由上海英骏生 物技术有限公司合成。RNAiso （TaKaRa公司）逆转录试剂 盒PCR扩增试剂盒RT-PCR试剂盒均为Fermentas公司。1.5 免疫荧光检测分别取 A549 细胞和细胞球种植于盖玻片上，在 37C， 5% CO2 条件下培养，待爬片完成后，取出玻片用 4%多聚甲醛固 定，用PBS润洗后用0.3% Triton X-100透化处理，然后封闭 后加入一抗（1:400）, 4C冰箱孵育过夜。第2天，取出玻片， PBS洗涤后加入二抗（1:500）, 37C避光孵育1 h,然后用PBS 洗涤，用 Hochest33258 染色， PBS 洗涤后抗荧光淬灭剂封片， 共聚焦显微镜观察拍照。1.6 Western blot收集 A549 细胞和细胞球，用蛋白裂解液提取总蛋白，用 BCA法测定总蛋白浓度，制备蛋白样品，进行SDS-PAGE电 泳，浓缩胶80 V、30 min,分离胶120V、120 min，电泳完成 后转膜到PVDF膜，转膜结束后用含5%脱脂奶粉的TBST溶 液室温封闭4 ho封闭完成后用TBST洗膜，加入一抗4C冰箱 孵育过夜，然后再次洗涤，室温孵育二抗2 h,洗涤，采用化 学发光试剂盒（Pierce公司）按说明操作，用凝胶成像仪自动 曝光记录成像。1.7 统计学分析结果以x土s表示，应用SPSS17.0统计软件进行独立样本的t 检验。2 结果2.1 A549细胞球培养结果A549 细胞株在有血清培养条件下，在培养皿底部贴壁生 长，细胞呈短梭形，细胞生长迅速；而在无血清条件培养基条 件下，细胞呈球形立体生长，细胞球呈圆形或者椭圆形，球内 细胞结合紧密，球体饱满，折光性强，随着时间延长，细胞球 可逐渐增大，形状趋于规则。见图 1。2.2 细胞增殖能力和克隆形成能力结果分析用 MTT 比色法测定细胞增殖能力，并绘制细胞生长曲线， 结果显示，细胞球的增殖能力显著高于普通贴壁细胞（P 0.05） （图2A）o为检测细胞的体外克隆能力，将细胞和细胞球分别 接种于平皿，进行平皿克隆实验，结果显示，细胞球的平皿克 隆形成能力克隆数（） 显著高于贴壁细胞克隆数（），P 0.05,图2Bo上述结果说明细胞球比贴壁细胞体外增殖能 力明显提高，具有更强的自我更新能力。2.3 A549细胞和细胞球干细胞相关标记表达分析运用RT-PCR分别检测A549细胞和细胞球的肿瘤干细胞 标记表达情况，结果提示细胞球的 Sox2 （）和 Oct4（）的表达水平要高于贴壁细胞分别为（）、（）,图3A。Western blot检测在蛋白水平上也证实了这一点（图 3B）。免疫荧光检测结果显示，Sox2和Oct4免疫荧光染色后激 光共聚焦显