目录前言.11 菌种的选育.2 1.1 菌种的选育及制备.2 1.2 诱变育种.3 1.3 菌种的保藏.52 培养基的设计及灭菌.6 2.1 培养基的类型及功能.6 2.2 培养基的成分.6 2.3 培养基的设计及优化 .7 2.4 培养基设计时注意的问题.8 2.5 培养基灭菌.83 空气灭菌.9 3.1 过滤除菌流程及设备.9 3.2 无菌空气的检查.11 3.3 发酵罐灭菌.114 种子的扩大培养.12 4.1 实验室种子制备.12 4.2 生产车间种子制备.125 发酵过程的参数控制.13 5.1 发酵过程的补料策略.13 5.2 发酵过程pH值的控制.13 5.3 发酵过程温度的控制.13 5.4 溶氧的控制.14 5.5 最佳接种量.14 5.6 泡沫的影响及控制.14 5.7 染菌的控制.146 下游加工.15 6.1发酵液的预处理和固液分离.15 6.2细胞破碎及其碎片的分离.15 6.3辅酶Q10的提取与纯化.157物料衡算.168发酵罐的设计.17 8.1发酵罐的结构.17 8.2发酵罐的工艺尺寸.17 8.3通用式发酵罐的选择.189工艺流程图.20参考文献.22 前言 辅酶Q10又名泛醌10，是一种脂溶性醌,其结构类似于维生素K，因其母核六位上的侧链聚异戊烯基的聚合度为10而得名，是一种醌环类化合物。化学名 2-(3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-癸甲基-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-四十癸烯基)-5,6二甲氧基-3-甲基-p-苯醌 结构式 辅酶Q10分子结构分子式 C59H90O4 分子量 863.36辅酶Q10受光照易分解，而受温度、湿度影响则较小。在室温下呈橙黄色结晶物，是呼吸链上的一种递氢体，在自然界分布广泛。主要功能有自由基清除剂、抗肿瘤药物、增强免疫力、代谢激活剂，在细胞能量转换中具有重要作用、抗氧化作用、增强心脏对缺氧的忍耐力。辅酶Q10的生产方法有动植物组织提取法，化学合成法和微生物发酵法，化学合成法合成条件苛刻，步骤繁多；另外化学合成的辅酶Q10的异戊二烯单体大多为顺式结构，生物活性不好，且副产物含量多，提纯成本高。动植物组织提取法主要是从提取细胞色素C后的猪心残渣提取。动物组织中辅酶Q10含量低，每公斤新鲜猪心的收率仅为75mg，并受原材料和来源限制，规模化生产受到一定制约。微生物发酵法是目前认为最具发展前景的辅酶Q10生产方法。该方法生产的辅酶Q10产物活性好，可通过规模放大生产能力。 其技术关键是辅酶Q10产生菌的生产能力及分离纯化方法。由于受菌种、发酵工艺以及下游提取的工艺的限制，微生物法生产得到的辅酶Q10的产量不高，目前还无法满足工业化生产的要求。 通过诱变育种、构建工程菌、优化发酵工艺、优化提取纯化工艺等策略，能最大限度地提高辅酶Q10的产量，有望实现辅酶Q10的工业化生产。1.菌种的选育1.1菌种的选育及制备 优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。 辅酶Q10产生菌及其细胞内含量 辅酶Q10产生菌 含量（mg/g 干细胞）深红红螺菌 5.4 沼泽红假单胞菌 3.9嗜硫小红卵菌 3.6类球红细菌 2.7荚膜红假单胞菌 1.4黑粉菌 0.2铜绿假单胞菌 0.6掷胞酵母 0.4新生隐球菌 0.2从上表可以看出，光合细菌菌体中辅酶Q10的含量普遍较高。在分类地位上，光合细菌属于原核生物界细菌门真细菌纲红螺菌目，该目分为红螺菌和绿硫菌亚目，前者分为红硫菌科和红螺菌科。上述高产菌种大都属红螺菌科，因此红螺菌科细菌是产CoQ10菌种理想选择之一。红螺菌属细胞进行二分裂，革兰氏染色阴性。光和色素为细菌叶绿素a和螺菌黄素类类胡萝卜素。淡水菌种，生长不需要氯化钠，喜在光照厌氧条件下光异养生长，但也可在黑暗条件下微好氧或好氧生长，生长需要生长因子。本实验选择深红红螺菌作为生产用菌种，培养条件须为厌氧光照，有CO的存在。菌种选育的一般步骤为：含微生物材料的选择材料的预处理所需菌种的分离菌种的培养菌落的选择菌种初筛菌种复筛野生菌株菌株保藏。1.1.1含微生物材料的选择 由于红螺菌能进行光合作用，适宜生长在缺氧，光照充足的地方。广泛分布于江河、湖泊、海洋等水域环境中，尤其在有机物污染的积水处数量较多，故所取生物材料为污水处理厂的活性污泥。选好4到5处取样点，每处取10g污泥样品，并混合放置在预先灭菌的容器中，记录好时间，地点和环境等情况，以备查考。1.1.2材料的预处理 将取得的样品放在缺氧、不含氯化钠、富含有机物的的条件下进行培养，并控制PH在接近中性的范围类，在厌氧条件下能进行光能异养生长的红螺菌科将逐渐占据优势地位，其他杂菌的生长将受到抑制。1.1.3所需菌种的分离可利用选择培养基对预处理后的材料进行富集液体培养，施加选择压力 ，在培养基中可以加入较多有机物，并且把葡萄糖作为碳源，在严格厌氧条件下进行培养，同时控制PH值在6.5与7.5之间，放置在光照充足的地方。这样红螺菌属将取得生长优势地位。然后可以用平板划线法进行菌种分离。方法如下：用接种管蘸取少量经增殖培养后的菌液，在含无菌固体培养基的平板表面上进行规则划线，操作时由右向左轻轻划线，划线时平板面与接种环成3040，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，线条要平行密集，使两线不能重叠，充分利用表面积，划线时接种环不要嵌入板内划破培养基，密集的含菌样品，经过多划线稀释，使菌体在平板培养基上逐渐分离成单个菌株，经培养繁殖成单个菌落，反复进行几次平板划线分离，可得红螺菌野生菌株。1.1.4菌种的培养 将获得的菌株接种到半固体培养基上进行培养，培养基的配方为：1L蒸馏水，30g葡萄糖，10g蛋白胨，20g琼脂，20gNaHCO，0.5gMgSO7HO，5gNaCl，1gNHCl；0.5g酵母膏，生长因子1ml，微量元素溶液1ml，pH值为7.0。培养一段时间后，培养基上将出现大小不一的特征菌落。1.1.5菌落的选择 培养48h后，挑取比较大的浅红色菌落，常用的方法有铺菌法、复印平板法。菌落的筛选时选育过程中最耗时和最困难的步骤，所以应该采用合适的方法，减轻工作量。1.2诱变育种 由于野生型菌株生产性能较差，因此通常会对出发菌种进行诱变处理，从而选育出高产菌种。诱变育种可以利用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合要求的个体，进而培育成新的品种。诱变剂包括物理、化学、生物诱变，在微生物诱变育种中，可用物理化学复合诱变因素处理菌种，扩大突变的位点范围，使获得正突变的菌株的可能性增大。因为不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱