烟草原生质体培养与细胞融合技术研究进展XXX(云南农业大学烟草学院XX级，云南 昆明650201)摘要：随着科技的迅速发展，各项农业生产技术也在迅速壮大并趋于成熟。原生质体的培养 与细胞融合技术的发展也得到较好的发展。本文对植物原生质体培养与细胞杂交技术中的关 键环节做了阐述，并综述了原生质体培养与细胞融合技术的一些研究成果、研究进展以及在 烟草生产中的利用。关键字：烟草；原生质体培养；细胞融合原生质体是指除去细胞壁或是说一个被质膜所包围的裸露细胞1。从 20 世 纪 70 年代开始，植物原生质体培养和体细胞融合技术一直都是研究的热点，并 成为细胞工程技术的一个重要分支。在这近 40 年的时间里，经过众多研究者的 研究，一系列关键性的试验方法得以发展，各种技术难关得到逐步突破，原生质 体培养和细胞融合技术也已广泛应用于生物科学众多领域的研究和发展。在植物 品种改良和创造远缘杂种发面成就最为突出。就此，作者对原生质体培养和细胞 杂交技术的关键环节，研究成果和进展进行综述，并对此技术在烟草生产中的应 用做相关阐述，以此为相关领域的研究提供参考。1 原生质体培养1.1 原生质体研究发展史原生质体(protoplast) 词是1880年由Hanstein首次起用的。Cocking首次应 用酶法制备番茄根原生质体获得成功；1971年，Takebe等首次得到烟草叶肉原 生质体培养的再生植株；1972年Carlson利用硝酸钠进行了烟草种间原生质体融 合； 1974 年，高国楠利用聚乙二醇进行了大豆原生质体与烟草原生质体间融合； 1976 年, Smith诱导了人的Lela细胞与烟草细胞原生质体间的融合；1985年， Fujimura 等将第一例禾谷类作物水稻原生质体培养再生植株； 1986 年， Spangenberg 等用单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功2。自从1971年Nagat和Takdz首次利用烟草叶片分离原生质体，并培养获得 再生植株以来，迄今至少已有46个科160多个属的360 多种植物（含变种和亚种） 的原生质体再生植株问世3。1.2 原生质体的游离原生质体的游离是原生质体培养成功的一个重要环节。前人指出在分离前， 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量 和活力。目前，分离原生质体的方法有两种：机械分离法和酶解分离法。原生质体的机械分离是借助于利器（如刀等）或机械磨损等措施使细胞壁 破损，促使原生质体释放的方法4。但是此方法只能获得少量的原生质体，完整 的原生质体就更少。因此，用的较多的是酶解分离法。酶解分离将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶 液的作用下细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法5。在此法中 常用到的酶种类有纤维素酶类、果胶酶类、蜗牛酶和胼胝质酶等。其中纤维素酶 类包括纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶；果胶酶类包括果胶酶和离析酶。纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶、崩溃酶主要用于细胞壁的分解 其中果胶酶、离析酶主要是分解细胞之间的果胶，促使细胞彼此分开。在原生质 体分离时，常常将降解纤维素的酶和分解果胶的酶混合使用，利用果胶酶分解果 胶质的特性从组织中将细胞游离出来，再在纤维素酶的继续作用下把细胞壁分解 而释放出原生质体。蜗牛酶和胼胝质酶主要用于花粉母细胞的四分孢子原生质体 的分离，因为花粉母细胞和四分孢子的细胞壁中除有纤维素外，还有由几丁质和 多糖等构成的胼胝质6。虽然酶解法适用，应用广泛，但同时由于商品酶制剂均 含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，会影响所获原生质体的活力。1.3 植物原生质体的培养一般情况下，原生质体在适宜培养基上和适宜培养条件下经培养24d可 再生细胞壁，并很快进行细胞分裂， 3060d 出现肉眼可见的细胞团，随后细胞 继续分裂增殖，几个月后形成愈伤组织或胚状体，最后形成完整小植株。原生质体的培养类似于单细胞培养，培养方法有四种，即固体包埋培养法、 液体浅层培养法、双层培养法和琼脂糖珠培养法。固体包埋培养能提高培养初期 原生质体的成活率，利于定点观察，但不利于通气和培养后期代谢物的排出。相 比而言，多数实验者喜欢采用液体 浅层培养法。这种方法的优点是培养物与空 气接触面大，易于通气， 添加更换培养基和转移操作方便，细胞悬浮培养中产 生的有害代谢 产物易于扩散，但不利于定点观察，易造成原生质体局部密度过 高或过低。在固液双层培养法中，Shillito等叨建立的念珠培养法是比较好的一种 方法，它是将含有原生质体的琼脂糖培养基切成小块放 在液体培养基中进行振 荡培养。用这种方法，明显提高了矮牵牛( Petunia hybridia )、番茄( Lycopersicum esculentum )、芜菁( Brassica rapa ) 等原生质体培养的效果7。在上述培养方式 中，均可以加入未去壁但失去分化能力的完整细胞进行原生质体的看护培养 ( nurse culture ),能明显提高培养效果。 Mitsugu 等8用这样的方法，极大提高了百 合 ( Lilium L. ) 原生质体培养初期的成活率。在培养基的选择上，要针对材料做适当的改良。大量元素中Mg2+、Ca2+浓 度变化最多，铵态氮和硝态氮的比例及用量，不同实验也不尽相同。对碳源的要 求一般不专一，多数采用蔗糖，或者以蔗糖和葡萄糖混合使用作为碳源营养。在 激素使用上，一般须在含有一种生长素和一种细胞分裂素的培养基中才能正常分 裂和生长9。最常用的外源生长素是2,4-D,但对细胞分裂素的需求，各种文献 报道不一致。原生质体对外源激素的需求可能会随培养时间的推移而发生改变。 如烟草 ( Nicotiana tabacum ) 原生质体在培养基中生长素水平降低或其作用消 除后,会迅速生长并随之发生植株再生10。此外，用于单细胞培养的一些技术，如悬滴培养、微室培养、看护培养等技 术，也在原生质体培养中得到应用，特别是用于低浓度原生质体培养。1.4 原生质体培养的意义1) 单细胞无性系的建立通过原生质体的培养可以产生单细胞无性系，而单细胞无性系为在细胞水平 上进行突变体的筛选、次生代谢物生产、人工种子生产、种质资源库的建立提供 了非常理想的受体系统。2) 遗传转化的良好受体 原生质体无细胞壁，易于摄取外源遗传物质、细胞器、微生物等，为植物基因工程研究提供了理想的遗传实验操作体系3) 多种基础研究的实验体系利用原生质体可以进行基础理论的研究，如细胞生理、基因调控、风化和发 育、细胞质膜结构和功能、植物细胞壁再生、病毒侵染机理及细胞器的互作等方 面研究。4) 体细胞杂种的形成由于细胞壁被溶解，有利于细胞间相互融合，克服了常规育种中远缘种属间 由于生殖隔离而造成的杂交障碍，实现了远缘种属间遗传信息的交流。包括植物 细胞的核质替换、细胞质杂种的获得等。1.5 影响原生质体培养的因素1) 原生质体的活力 拥有大量的，具有活力的原生质体决定着原生质体培养能否成功。2) 原生质体的起始密度适宜密度在104105个/mL左右。如在烟草叶原生质体培养中，密度低于103 个/mL时，细胞只能分裂一、二次，密度在104个/mL以上，植板率常显著提高 10。3) 渗透压稳定剂在没有形成细胞壁前，原生质体的培养必须有培养基渗透压的保护。据前人 11研究表明培养 78d 后，大部分有活力的原生质体已经再生出细胞壁并通过几 次细胞分裂，形成细胞团。此后，通过定期加入几滴不含渗透压剂或渗压剂水平 很低的新鲜培养基，逐渐降低培养基渗透压，最后将肉眼可见的细胞团转入不含 渗压剂的新鲜培养基中。但有的原生质体在培养过程中对外界环境中渗透压的变 化很敏感，即使到愈伤组织阶段也如此，渗透压稍一降低就会引起原生质体或愈 伤组织的大量死亡12。高渗透压培养基中的原生质体形成细胞团和愈伤组织比 较紧密，细胞较小、胞质较浓厚，具有较高的分化植株能力。4) 培养基营养5) 培养条件光照和温度是影响原生质体培养的重要培养条件。6) 植物材料和基因型植株的形态发生是受基因控制的复杂过程。不同基因型的原生质体再生植株 形态发生的能力也不相同2.细胞融合细胞融合也叫细胞杂交、原生质体融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和 培养，在离体条件下用人工方法将原生质体（除去细胞壁的不同种类的细胞）通 过无性方式融合合并成一个核或多核的杂合细胞的过程 13。细胞融合属于细胞 整体水平的细胞工程。从原生质体再生完整植株的成功，最终引发了将不同遗传背景的细胞组合在 一起的尝试。经过近 30 年的努力，人们建立起一套完整 的体细胞杂交体系，它 可能使不能通过有性过程杂交的亲本之间进行核基因的重组或胞质基因的重组。 这套技术体系包括诱导原生质体的融合、选择融合体或杂种细胞及杂种植株的再 生与鉴定14。2.1 原生质体融合技术的发展自C a r l s o n等在1972年获得第一株烟草体细胞杂种植株以来，原生质 体融合技术在植物中已广泛应用。据不完全统计，到 2003 年初已获得木本植物 近100个组合的体细胞杂种植株16】;Terada- R.等M最早在1987年，将稗草与 水稻的原生质体融合，获得了杂种水稻植株，至1999年底，已获得17例水稻体 细胞杂交组合的杂种植株18； 现已有10多种植物性细胞的20多个不同组合的 配子体细胞杂交实验，有的已获得再生植株。2.2 原生质体融合方法 原生质体的融合方法经历了一个逐步改进和完善的过程。在早期原生质体融 合的方法有NaNO3法、高pH/高Ca2+法、PEG（聚乙二醇）法，后来逐渐发展为 PEG与高Ca2+、高pH相结合;20世纪80年代初又开始探索使用电融合法，并 发展出一些其他方法。这些方法各有特点，但目前广泛使用的是PEG法和电 融合法。1974 年高国楠建立了 PEG 法，经过不断改进已逐步走向完善， 并得到广 泛应用20， 其融合频率可达 10%15%，无种属特异性，几乎可诱导任何原生质 体间的融合。在应用PEG进行融合时，重要的影响因素是PEG的种类、纯度、 浓度、处理时间、原生质体的生理状况和密度。近年来一些研究建议在PEG溶 液中加入融合促进剂（ 如伴刀豆球蛋白、二甲基亚砜等） ，可有效提高原生质体 的融合频率。最近PEG诱导成对原生质体融合的成功，使得P E G融合技术更精 确化,并有可能免除杂种细胞的筛选21。 1 9 7 9年 S e n d a 建立的电融合法发展 迅速， 是目前最流行的融合方法22。至今已广泛应用于动植物及微生物细胞的 融合。该方法对细胞没有毒害作用，并且操作简便，融合同步性好，可在显微镜 下观察融合的全过程，整个过程中的参数容易控制。但是电融合法需要昂贵的电 融合仪，因此目前仍不如PEG法适用普遍。Schweiger】23把电融合法与微培养法 相结合，建立了单对原生质体融合技术程序，这是近年来融合技术上取得的最突 出的成就， 它不仅改进了融合方法， 而且是两亲本间一对一融合， 有可能解 决融合细胞的选择问题，是一种有前途的技术体系。目前正在研究用电脑控制进 行自动化操作，以提高操作效率24。配子体细胞原生质体融合技术主要借鉴了体细胞原生质体的融合方法。 性细胞原生质体对融合处理很敏感，容易与其它原生质体融合 25。但是因为它 的形态、密度等多不同于体细胞原生质体， 其融合技术与体细胞杂交有所差异。 影响因素主要有融合处理方式、 原生质体密度与比率、融合诱导剂的浓度等。 性细胞原生质体往往形体小而密度大，为了提高融合效率，通常在提高性细胞原 生质体密度的同时，相对降低后者的密度，以寻求最佳比例26,27。2.3 原生质体