胰酶制备新工艺的研究作者：吴晓英 张聚宝 林影 梁惠仪 李彦奇 【关键词】 胰腺 摘 要 目的 研究从猪胰腺中提取胰酶的新工艺。方法 使用=7.5%异丙醇为提取溶剂，添加=0.2% CaCl2和=1%胰酶粉为激活剂以及适量的保护剂，并加入NaHCO3使体系的pH稳定在6.57.0之间，在室温下提取3 h。结果 在优化工艺条件下，制得的胰酶制品中的胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的酶活力分别达5 200、 57 300、 37 000 u/g以上，为中国药典所规定的最低酶活的810倍，收率10%12%。结论 该工艺简单、提取效率高、产品酶活高。关键词 猪；胰腺；胰酶；胰蛋白酶；胰淀粉酶；胰脂肪酶Preparation of pancreatin from swine pancreasWU Xiaoying, ZHANG Jubao, LIN Ying, LIANG Hueiyi, LI Yanqi(Dept. of Bioengineering, South China University of Technology And Engineering, Guangzhou 510640,China)Abstract Objective To study the new processing technique of pancreatin from swine pancreas. Methods Used 7.5% isopropyl alcohol as extracting solvents; added 0.2% CaCl2 + 1% pancreatin as protecting agents; regulated pH 6.57.0 with NaHCO3; extracting time 3 h. Results Under optimum conditions, pancreatin with high activity and yield was obtained. The activities of trypsin, lipase and amylopsin were over 5 200 u/g, 57 300 u/g and 37 000 u/g respectively, and the yield was 10%12%. Conclusion It is a simple and time saving technique for the preparation of pancreatin with high purity, high activity and high yield.Key words swine pancreas; pancreatin; trypsin; steapsin; amylopsin胰酶是从猪、牛、羊等哺乳动物的胰腺中提取得到的一种混合酶制剂，主要成分为胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶，还有羧肽酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶和核糖核酸酶等。胰酶系我国和国际上多国药典收载的助消化药品，用于治疗消化不良、食欲不振及肝脏疾患引起的消化障碍等。此外，由于胰酶中含有多种活性成分，可作为原料药从中提取所需生化物质。同时，工业胰酶广泛用于皮革加工，它优于其他微生物来源的蛋白酶，对皮革的软化、脱脂、松紧度起较好的调节作用。国内外对胰酶的需求量较大。从猪胰腺中提取胰酶的工艺已有不少报道14，但活性和收率不尽满意，为更充分利用有限的胰腺资源，参照国内外的文献57，比较了不同提取工艺的优缺点，对胰酶制备的多种条件如激活剂、提取溶剂、保护剂、激活时间和酸度等进行探索，建立一条利用稀异丙醇从猪胰腺中提取胰酶的新工艺。1 材料与方法1.1 实验材料 猪胰腺、十二指肠、苦胆均由广州茅山肉联厂提供，在屠宰后1 h内放入冰盒中保温，在3 h内胰腺和十二指肠放入20 冰箱中冷冻，胆汁置细口瓶中在4 冰箱中保存。1.2 试剂 酪蛋白，供胰酶测定专用，中国药品生物制品检定所提供；马铃薯淀粉，生化试剂；其他试剂均为分析纯。1.3 仪器 756MC紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；LD5-2A医用离心机，北京医用离心机厂；PHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司雷磁仪表厂；WX-2型真空泵，临海市精工真空设备厂；ZK82B真空干燥箱，上海实验仪器厂。1.4 测定方法 胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶的酶活力测定和炽灼残渣、干燥失重均按中国药典8方法进行。1.5 基本工艺冻胰，绞碎适量稀异丙醇 保护剂、激活剂 调pH 25 下搅拌激活胰浆=30%35% 异丙醇 过滤 提取液=55%65%异丙醇 沉淀物丙酮 真空干燥胰酶成品2 结果与讨论2.1 激活剂种类和用量的影响一般的胰酶制备工艺中，蛋白酶的激活，多采用自溶与加激活剂相结合的方法，激活剂包括Ca2+、胰酶粉、胆汁、十二指肠等，一般采用两种以上的激活剂，其中钙离子是必不可少的，因为胰蛋白酶原活化后进一步反应生成无活性的蛋白，加入0.02 mol/L Ca2+可以加速酶原活化而抑制副反应的发生，提高收率，同时Ca2+又能激活脂肪酶。缺点是Ca2+亦是引起胰酶炽灼残渣增高的主要原因，而苦胆却能克服这一缺点。苦胆与Ca2+对酶活、收率及炽灼残渣影响的对比实验结果见表1。表1 Ca2+与苦胆激活效果的对比（略）实验证明，苦胆激活的确可以减少炽灼残渣的量，但却可能引起酶活力损失，Ca2+激活所引起的炽灼残渣的量比苦胆激活稍高，但酶活力却得到较好的保持。因此，试图通过增加胰酶粉的加入量，减少Ca2+加入量，提高酶的活力。本文考察，当CaCl2加入量固定为胰浆重量的0.2%的条件下，不同胰酶粉的加入量对提取效果的影响。当胰酶粉的加入量为胰浆重量的0.4%时，酶活力与收率都偏低，而胰酶粉的加入量为胰浆重量的1% 时，激活效果较好。因此，以后的实验都采用02% 的CaCl2和1% 的胰酶粉为激活剂。2.2 保护剂对酶活力与三酶比例的影响 为了减少酶活损失，加入保护剂是必要的，目前国内对添加保护剂的研究不多，1999年的美国专利9列举了一系列的胰酶的保护剂，例如淀粉、麦芽糖、阿拉伯胶、山梨醇、牛血蛋白、甘油、盐等，也可用葡萄糖酸钙，既起激活效果，又达到保护的目的。一般淀粉是首选，它对淀粉酶有很好的保护作用，而淀粉酶的降解速度比脂肪酶和蛋白酶快很多。本研究选取淀粉、麦芽糖、氯化钠作为保护剂，并比较保护剂对酶活和三酶比例的影响。从表2可以看出不加保护剂时所得胰酶制品的胰蛋白酶活性较高和炽灼残渣都比较低，但胰脂肪酶、胰淀粉酶的酶活较低。加保护剂后三酶比例比较合理，炽灼残渣也基本符合标准。可见，加入一定量的保护剂对保证胰酶的质量是必要的。表2 保护剂对酶活与三酶比例的影响（略）以往的研究表明2，胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶在激活时出现活力峰值的时间不同，所以为保证产品中三酶活力较高，往往采取添加保护剂的方法，使得即使超过激活时间，酶活的损失较少。这与实验结果也是吻合的，也证明加入保护剂的必要性。但是，保护剂的作用有限，它并不能防止酶原进一步水解，防止酶活力的回落。但它对酶活力损耗的延迟作用给生产带来很大方便，同时提高了成品酶的活力。2.3 异丙醇浓度对提取效果的影响国内的胰酶制备工艺一般使用乙醇为提取溶剂1-4，但乙醇对胰脂肪酶的活性有影响，本研究采用稀异丙醇为提取溶剂。异丙醇对胰酶的提取起到关键的作用：自溶，即促使胰酶从胰浆中充分地释放出来；抑菌，动物胰腺中生长着不少菌群，提取时易残留在胰酶产品中，使胰酶中含菌量超标，适当浓度的异丙醇对菌群的生长起抑制作用并可将某些菌杀死，特别是存在于自溶初期处于敏感状态的生殖细胞，因为它可以破坏某些菌的DNA结构并将其降解掉；降低胰浆的黏度，有利于下一步的操作，又可减少胰酶残留，有利于胰酶释放。 本研究对异丙醇浓度为5，7.5%，10,20对提取效果的影响做了探讨，从图2可以看出，最佳的异丙醇浓度为7.5%，在该浓度下所得的胰酶中蛋白酶酶活和收率都较高，同时消耗的异丙醇用量也少，节省成本。2.4 pH对提取效果的影响胰酶可在酸性或碱性条件下提取，一般加入适量的盐酸，在pH46进行提取，可提高收率，但需要较长的提取时间；而在pH68时胰蛋白酶自身催化反应速度最快，可缩短提取时间，但易引起酶活损失，因此必须控制好自溶时间以防胰酶的自身降解，也可通过加入保护剂以减少它的自身降解速度。本研究对提取体系的pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5对提取效果的影响做了探讨，结果如图3所示，最佳的提取pH为6.5，此时所得的胰蛋白酶活力和收率都较高。同时，在实验过程中发现提取体系的pH会随提取时间的延长而有所下降，因此本研究通过加入NaHCO3来代替传统工艺中的NaOH,在体系中起pH缓冲作用，使pH稳定在6.57.0之间，以保证提取效果。2.5 提取时间对提取效果的影响控制好适当的提取时间是获得高酶活、高收率胰酶的关键，目前报道的工艺中自溶或提取时间各异，有的只需34 h，有的需放置过夜，甚至47 d，依不同的工艺而定。由于本工艺采用的是碱法提取，所需的提取时间相对较短，本研究对提取时间为2 h、3 h和4 h对提取效果的影响做了探讨。从图4可以看出最佳的提取时间为3 h。2.6 补加异丙醇工艺条件的确定当达到最佳自溶时间时，胰酶正处于高速自溶、极其敏感的状态，可通过加入适量的异丙醇使胰酶的自溶停止以防止其自身破坏作用。本实验通过加入一定量异丙醇使体系中异丙醇浓度为3035可使自溶停止，同时又可使胰浆的黏度大大地降低从而有利于除去纤维残渣，而不会引起较大的酶收率损失，省去二次提取的成本。2.7 胰酶的沉淀与脱脂2.7.1 沉淀剂浓度的确定本研究所采用的异丙醇浓度为5565，若小于55则收率降低，若高于65则会引起胰酶的抑制反应使蛋白酶的活力降低。并且最好用冷至4 以下的异丙醇沉淀，以加快沉淀速度，缩短沉淀时间，减少酶活的损失。2.7.2 胰酶脱脂本研究所采用的脱脂剂为冷丙酮。脱脂方法是用冷至4 以下的丙酮洗涤离心所得的产物，之后进行抽滤，然后再用丙酮分23次进行洗涤。脱脂是影响产品外观和产品产率的重要因素，所以应尽量做到脱脂完全。2.8 优化工艺的验证实验按上面的优化工艺条件，我们制备了3批胰酶，并进行了测定，结果如表3。表3 优化工艺所得胰酶的测定结果（略）3 结 论本研究通过对从猪胰腺中提取胰酶的工艺进行探讨，确定优化工艺为：使用=7.5%异丙醇为提取溶剂，添加=0.2% 的CaCl2和=1% 的胰酶粉为激活剂以及适量的保护剂，并加入NaHCO3使体系的pH稳定在6.57.0之间，在室温下提取3 h，通过加入适量异丙醇使体系中异丙醇体积分数为3035使自溶停止，过滤，于滤液中加入适量异丙醇使体系中异丙醇体积分数为5565使胰酶沉淀，用冷丙酮脱脂，40 下真空干燥。在优化工艺条件下，制备的胰酶制品的胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的酶活力分别达5 200、57 300、37 000 u/g以上，为中国药典所规定的最低酶活的810倍，平均收率10%以上，同时胰酶制品的炽灼残渣也符合出口要求。本研究的制备胰酶的新工艺具有工艺简单、提取效率高、产品酶活高、成本低、生产周期短的特点