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双向电泳实验流程l 样品制备(Sample preparation)l 固相预制胶条的水化(IPG strip rehydration)l 第一向等电聚焦(IEF)l 胶条的平衡(IPG strip equilibration)l 第二向SDS-PAGE电泳(SDS-PAGE electrophresis)l 凝胶的染色及检测(Detection/Staining)l PDQuest软件分析(Software analysis)l 质谱鉴定(Protein identification)目录第一章双向电泳1. 1 溶液配制1. 2 操作步骤1. 3 注意事项第二章订货信息附录1双向电泳完整的操作步骤附录2聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3细胞样品的一般处理步骤附录4组织样品的一般处理步骤第一章 双向电泳1. 1 溶液配制水化上样缓冲液(I)尿素8M4.805gCHAPS 4%0.4gDTT65mM0.098g(现加)Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml(40%)(现加)溴酚蓝0.001%10ml(1% 溴酚蓝)MilliQ水定容至10ml分装成10小管,每小管1ml,-20冰箱保存。水化上样缓冲液(II)尿素7M4.2g硫脲2M1.52gCHAPS 4%0.4gDTT65mM0.098g(现加)Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml(40%)(现加)溴酚蓝0.001%10ml(1% 溴酚蓝)MilliQ水定容至10ml分装成10小管,每小管1ml,-20冰箱保存。水化上样缓冲液(III)尿素5M3.0g硫脲2M1.52gCHAPS 2%0.2gSB 3-10 2%0.2gDTT65mM0.098g(现加)Bio-Lyte0.2%(w/v)50ml(40%)(现加)溴酚蓝0.001%10ml(1% 溴酚蓝)MilliQ水定容至10ml分装成10小管,每小管1ml,-20冰箱保存。胶条平衡缓冲液母液尿素6M36gSDS2%2gTris-HCl0.375M pH8.825ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl)甘油20%20mlMilliQ水定容至100ml分装成10管,每管10ml,-20冰箱保存。胶条平衡缓冲液I胶条平衡缓冲液母液10mlDTT0.2g充分混匀,用时现配。胶条平衡缓冲液II胶条平衡缓冲液母液10ml碘乙酰胺0.25g 充分混匀,用时现配。低熔点琼脂糖封胶液低熔点琼脂糖0.5%0.5gTris25mM0.303g甘氨酸192mM1.44gSDS0.1%1ml(10% SDS)溴酚蓝0.001%100ml(1%溴酚蓝)MilliQ水定容至100ml加热溶解至澄清,室温保存。30% 聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g甲叉双丙烯酰胺4gMilliQ水500ml滤纸过滤后,棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris碱 pH8.8Tris碱90.75gMilliQ水400ml用1mol/L HCl调pH至8.8,加MilliQ水定容至500ml。4冰箱保存。10% SDSSDS10gMilliQ水100ml混匀后,室温保存。10% ApAp0.1gMilliQ水1ml(用时加水溶解)溶解后,4冰箱保存。10电泳缓冲液(1= 25mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3)Tris碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混匀后,室温保存。1. 2 操作步骤(一)第一向等电聚焦(用自制溶液)1. 从冰箱中取-20冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室温溶解。2. 在小管中加入0.01g DTT, Bio-Lyte按照如下表格1ml的量加,充分混匀。IPGpH RangeBio-Lyte Ampholyte(Stock)Range Conc.(w/v)Sample Solution VolumePer 1ml per 5ml per 50ml3-103-1040%5ul25ul250ul4-74-640%2.5ul12.5ul125ul5-740%2.5ul12.5ul125ul3-63-520%5ul25ul250ul4-640%2.5ul12.5ul125ul5-85-840%5ul25ul250ul7-107-940%2.5ul12.5ul125ul8-1020%5ul25ul250ul3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品,充分混匀。其中水化缓冲液与样品的比例不得小于4:1。具体的上样体积如下表,ReadyStripTM IPG胶条的长度上样体积7 cm125ul-250ul11cm185ul-370ul17cm300ul-600ul18cm315ul-630ul24cm410ul-820ul其中蛋白质的上样量与染色相关。具体的蛋白质上样量如下表,IPG胶条的长度分析型的上样量(银或SYPRO Ruby染色)制备型的上样量(考马斯亮蓝染色)7 cm10-100ug蛋白200-500ug蛋白11cm50-200ug蛋白250-1,000ug蛋白17cm100-300ug蛋白1-3mg蛋白4. 从冰箱取-20冷冻保存的IPG预制胶条,于室温放置10分钟。5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。7. 分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。8. 在每根胶条上覆盖矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。IPG胶条的长度矿物油体积7 cm1 ml11cm2 ml17cm3 ml18cm3ml24cm5ml9. 对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。7cm胶条水化12小时(17)被动水化S1250V慢速25分钟除盐S21000V快速60分钟除盐S34000V线性3小时升压S44000V快速24,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。(30-50mA/根)l 设置等电聚焦时的温度。(17)11cm胶条水化12小时(17)被动水化S1250V慢速25分钟除盐S21000V快速60分钟除盐S37000V线性4小时升压S47000V快速40,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。(50mA/根)l 设置等电聚焦时的温度。(17)17cm胶条水化12小时(17)被动水化S1250V慢速25分钟除盐S21000V快速2小时除盐S38000V线性5小时升压S48000V快速60,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。(50-70mA/根)l 设置等电聚焦时的温度。(17)18cm胶条水化12小时(17)被动水化S1250V慢速25分钟除盐S21000V快速2小时除盐S38000V线性5小时升压S48000V快速60,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。(50-70mA/根)l 设置等电聚焦时的温度。(17)24cm胶条水化12小时(17)被动水化S1250V慢速25分钟除盐S21000V快速2小时除盐S310000V线性5小时升压S410000V快速80,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持l 选择所放置的胶条数。l 设置每根胶条的极限电流。(50-70mA/根)l 设置等电聚焦时的温度。(17)10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20冰箱保存1到2天。(二)第二向SDS-PAGE电泳1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。将溶液分别注入玻璃板夹层中,上部留0.5cm的空间,用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后,表明凝胶已基本聚合。 2. 待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。3. 从-20冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其溶解。4. 配制胶条平衡缓冲液I。5在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在
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