实验三 水中大肠菌群的检测（多管发酵法）一、 实验目的1. 了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义。2学习检测水中大肠菌群的方法。二、实验原理1.相关性大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。大肠杆菌能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。水体中的病原微生物常因数量较少而难以检出，即使检出结果为阴性，也不能保证无病原微生物存在；同时检出手续也很复杂。所以，在实际工作中常借用检查水体中有无“指示菌”存在及其数量多少来判定水质是否被污染。大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个。大肠菌群是作为粪便污染指标提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中2.检测安全大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系。3.抗逆性因为水中致病性的治病菌比较少，同时饮用水中的大肠杆菌的数量也是较少的，而大肠菌群与治病菌的抗逆性一样，所以检测大肠杆菌就能反应出水样的质量。4. 数理统计通过对某些现象的频率的观察来发现该现象的内在规律性，并作出一定精确程度的判断和预测；将这些研究的某些结果加以归纳整理，逐步形成一定的数学概型，这就是数理统计的原理。就本次实验来讲，15支培养液中（其中有三类），5支装入的10ml水样，5支装入1ml水样，5支装入0.1ml水样，通过培养后，看各个种类的培养液中显示为阳性（黄色）的有几支，通过这些数据和报告中的表格，可算出每100ml水样中细菌的可能数。如果连0.1ml水样的5支均为黄色时，可取水样稀释100倍后，再求出大肠杆菌的可能数。5.微生物的代谢能量代谢是微生物新陈代谢的核心。绝大多数的微生物是异养生物，它们利用有机物作能源，通过生物氧化以及与此相连的氧化磷酸酸化或底物水平磷酸化反应形成ATP。生物氧化必须经历脱氧，递氢和受氢三个阶段，并按其最终氢受体的性质而分为呼吸，无氧呼吸或发酵三种。呼吸的产能效率最高，无氧呼吸次之，发酵则最低。化能自养微生物因利用无机物的氧化取得ATP，故不但产生的能量少，而且还须通过能耗大的逆呼吸链反应产生固定C02所必须的还原力，因此它们的生长缓慢，生长得效率低。光能自养微生物可以通过循环光合磷酸化(如厌氧菌的光合细菌)，非循环光合磷酸化（如产氧的蓝细菌）或紫膜光合磷酸化取得ATP。微生物所特有的合成代谢途径种类繁多，最重要且有代表性的是C02的自养固定，生物固氮，细胞壁肽聚糖和微生物次生代谢物的生物合成。微生物的代谢调节具有可塑性强，灵敏度高和反应精确等特点，主要有调节酶合成量的酶诱导，阻遏机制和调节现成酶催化活力的激活和抑制尤其是反馈抑制机制两类。6.多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。 初发酵试验水样接种于发酵管内，37下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。48小时后仍不产气的为阴性结果。 平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。 复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。三、实验器材1. 水样自来水，中心湖水（稀释20倍），行政楼旁边水塘的水（稀释50倍）2试剂乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板。3 仪器及其它用品4 灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌移液枪，带塞灭菌试管。四、实验方法1 水样的采取水源水（大学城中心湖的水，广工行政楼旁边水塘的水）。2（1）初发酵试验。取16支发酵管，其中10支用移液管加入10mL一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5mL三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9mL自然水。完成后包装好，于121高压灭菌锅中灭菌30min左右。冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10mL水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1mL水样，向装有一倍的乳酸蛋白胨培养液的另5支试管中加入1mL10-1水样。 将各试管充分混均，置于37恒温箱中培养24h。注：本次实验没有经过平板分离和复发酵试验。水样总量：55.5ml(5管10ml水样，5管0.1ml水样，5管0.1 1:10稀释水样时，不同阳性和阴性情况下100ml水样中细菌的最可能数和95%可信限度值)五、实验结果（1）本次实验的所有试管都变成黄色，并且都产酸产气。查表得每升水源水样中大肠菌群数大于2400。本次试验用来稀释的水是自来水，虽然说自来水中的大肠菌群数量很少，但是水样中大肠菌群并不是均匀分布的，没有灭菌会带来误差。实验并没有在超净实验台上进行，空气中的微生物干扰很大。没有经过平板分离和复发酵操作，实验结果可信性降低了。但本次试验操作大体来说还是正确的，而且水样经过稀释之后试管的颜色变化很大，证明培养基里的大肠菌群存在比较多，所以中心湖的水污染比较严重，需要合适的治理。六、思考题1为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？答：原因主要有：1、大肠菌群的来源比较单一，主要来自于人体和动物的粪便当中，而且在自然界中容易死亡。与人体内致病细菌来源有很大相关性。2、大肠菌群与致病菌的抗逆性一直，在自然界中致病菌与大肠菌群的存活机率是一致的。3、大肠菌群检测简易，所得结果可靠。4、致病菌相对比较难测量。5、样品检测大肠菌群常有，致病不常有。