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细胞裂解(蛋白质提取)一、试剂配置:PBS配方氯化钠(MW 58.44)130mM8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358)10 mM3.63g磷酸二氢钾(MW 136)2 mM0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。Washing buffer(500mL)配方Tris(MW 121.1) 10mM0.605g蔗糖(MW 342) 250mM42.75g加水溶解,用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22四m滤膜过滤(使用1M盐酸略高于2750uL调pH)裂解储液配方(细胞):尿素(MW 60.06) 7M4.2g硫脲(MW 76.12)2M1.52gCHAPS(MW614.89)4% (W/V)0.4g加超纯水定容至10mL后经0.22四m 一次性滤膜过滤,过滤后 分装成20小管,每小管500uL, -20C冰箱保存。裂解储液配方(组织):尿素(MW 60.06)5M3g硫脲(MW 76.12) 2M1.52gCHAPS(MW614.89) 2%0.2gTris (MW 121.1) 40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22四m 一次性滤膜过滤,过滤后 分装成20小管,每小管500uL,-20C冰箱保存。裂解液:裂解液储液100uLIPG buffer (pH 可选)2%2uLPi2uLNucLease mix (100X)1uLPMSF (100mM: 20mg/mL)1mM1uLDTT (0.411g/mL)40mM1.5uLPi:每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250:考马斯亮蓝G-2500.01%100g95% 乙醇4.7%50mlH3PO48.5%85g将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中,与用水溶解的 100mlH3PO4混合后稀释至1000ml,之后使用滤纸过滤。二、实验准备:1、准备冰盒,细胞裂解过程均在冰盒内进行(4C);2、准备4笆离心机,开机降温,保证温度下降至4C;3、取出置于-20C保存的试剂,需冰上融化,最后取出细胞样品。三、样品制备:(一)细胞细胞裂解准备:1、收集细胞,使用大于500g转速离心5min;2、弃去上清,使用washing buffer重悬细胞沉淀,震摇待 细胞完全打散后,继续用大于500g转速离心5min;3、重复步骤2两次,并使用转速2000rpm离心5min,弃上清。 细胞可置于-80冰箱保存数周,或使用裂解液裂解。细胞裂解:1、配置裂解液:注意先不要加入DTT。临用前加入PMSF后, 立即将细胞裂解液加入待裂解的细胞中。2、加入裂解液的细胞置于冰盒内,每隔5-7min取出,于漩 涡振荡器上震摇数秒,并再次放于冰盒中,保证细胞裂解 时的温度为4C。3、裂解15-20min后加入DTT。4、裂解完成后,置于4笆离心机中,以最大转速13200rpm离 心30min,取上清,弃沉淀。上清所含提取的蛋白。5、使用bradford法测定提取蛋白浓度。(二)、组织:组织裂解准备:1、提取动物组织。提取时务必保证组织的纯度,尽量减少组织 混杂,尤其注意血液的混入。2、使用washing buffer冲洗组织2-3遍,洗净组织的血液、体 液、和其他影响实验结果的残留成分。3、准备研钵,洗净并且烘干,准备适量的组织裂解液,准备充 足的液氮,石英砂适量。组织裂解:1、配置裂解液:注意先不要加入DTT、PMSF。2、将适量石英砂加入到研钵中,加入液氮冷却。3、将组织放入装有液氮的研钵中,研磨组织,在研磨过程中保 证样品在低温状态下。4、研磨完成后将样品及石英砂收集到离心管中,在裂解液中迅 速加入PMSF,混匀后将裂解液加入含有样品的离心管中。保 持4C,震荡混匀,每隔5-7min取出,于漩涡振荡器上震摇 数秒,并再次放于冰盒中。5、裂解15-20min后加入DTT。6、使用2000g离心10min,吸取上清即为所提取的蛋白,下层 石英砂及组织碎片则丢弃。将上清使用13200g转速离心,弃 去沉淀。(三)、血清:血清样品可直接用于双向电泳实验。但样品中含有大量的IgG和白蛋白,需要使用试剂盒去除。四、试剂说明:裂解液成分:溶液中还原剂的含量不要超过20mM。尿素/硫脲:变性剂,中性促溶剂,促进样品溶解,破坏氢键等 次级结构,使所有离子基团暴露在溶液里。硫月尿可以促进膜蛋白 的溶解。尿素在30C以上容易降解,降解产物异氰酸盐可使样 本中蛋白质甲氨酰化,对蛋白质进行修饰,造成等电点改变,形 成人为地“斑点串”。CHAPS:两性表面活性剂,CHAPS是一种非变性的zwitterionic 去垢剂、蛋白质裂解液,用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之 间的相互作用。CHAPS是两性离子去垢剂,分子结构中具有一 个胆酸和硫代甜菜碱。在紫外区的低吸光性成为用紫外方法检 测膜蛋白的首选去垢剂,CMC值均为8 mM。常用于于双向电泳 等实验。原理:CHAPS保护蛋白质的天然状态,可溶解膜蛋白, 从而互作用。透析可除去。SDS: (FW288.38)离子型去垢剂,裂解力强,基本可以把细胞完 全破坏掉。并且使蛋白变性失活。不得与强氧化剂混合。它也可 以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸蛋白复合物。NP-40:乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P40;)很温和的非离子 型去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉胞膜,而对核膜破坏的作 用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。与蛋白结合力强, 用于防止物质分子疏水间相互作用,确保蛋白的充分溶解和结 构稳定。尤其用于膜蛋白的非变性条件下的溶解。TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚,一种非离子型表面活性剂, 能溶解脂质,以增加抗体对细胞膜的通透性。1%的Triton X-100 常用于漂洗组织标本,0.3%的Triton X-100则常用于稀释血 清,配制BSA等。能力介于NP-40和SDS之间,偏向于NP-40, 在保护蛋白活性方面有一定作用。EDTA:变性剂和稳定剂,通过螯合金属离子有效抑制蛋白酶的 活性。DTT:二硫苏糖醇,还原剂,储液配置:0.4g/mL。使用浓度约为 40mM。防止蛋白通过巯基氧化聚合,增加蛋白的可溶性。DTE:二硫赤酰糖醇,与DTT近似,也做还原剂。ASB14: Amidosulfobetaine 14,TBP:tri-Butyl-Phosphate磷酸三丁酯、三丁基膦,有毒,具有 较低的表面张力,难溶于水,常用作消泡剂。非巯基还原剂,使 用浓度为21,但溶解性有限,在溶液中不稳定,在样品制备时 需DTT联合使用。脱氧胆酸钠:Sodium deoxycholate,中度变性剂和蛋白溶解剂。SB3-10:硫代甜菜碱10,诱食剂,甲基供给剂。DeStreak试剂 和DeStreak水化溶液:将蛋白质巯基转变为稳定地二硫化物基 团,防止发生非特异性氧化反应,有效减少蛋白质在电泳过程中 因再氧化而发生的拖尾,特别是PH7-11的范围内(碱性蛋白质)。PMSF:苯甲基磺酰氟,储液配置(100mM) : 20mg/mL,在水中易失 活,使用异丙醇或DMSO配置。强大的不可逆蛋白酶抑制剂,抑 制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶以及含有巯基的蛋白酶, 使用浓度为1mM。浓度测定:核酸酶(Nuclease mix):核酸酶的构成是由牛胰腺Dnase 和Rnase以及维持最佳核酸酶活性所必须的各种辅助因 子组成。核酸酶受EDTA的干扰,使用核酸酶时避免加入 EDTA。可与蛋白酶抑制剂(PI)同时使用,但要注意必 须选择无EDTA的蛋白酶抑制剂。(注意:核酸酶试剂组 为悬浮液,使用前务必震荡混匀后分装。)考马斯亮蓝: Coomassie brilliant blue.考马斯亮蓝 G-250(Coomassie brilliant blue G-250)比考马 斯亮蓝R250多二个甲基。MW=854; A max=590-610nm。测定蛋 白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态 下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色, 蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值 与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与 考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反 应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。灵敏度比Lowry 法还高4倍,染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。优点 在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无 本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色,适于作定量分 析。可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为01 000Mg/mL。该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不 适用于小分子碱性多肽的定量。去污剂的浓度超过0. 2%影响 测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。考马斯亮蓝和皮肤 中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通 试剂洗掉。待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗 脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。R250较敏感,做定量 实验用,染胶效果较好.染色后为红蓝色。染色灵敏度比氨基黑 高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超 出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定 量分析时要注意这点。此方法优点:干扰物质少,K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、 糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是:(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作 标准曲线时通常选用g一球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的 偏差。(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污 剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和 0.1N 的 NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。(3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计 算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。蛋白质纯化一、目的:蛋白质纯化的日的在于去除样品蛋白中的盐、糖以及一些大分子杂质,杂质的存在严重影响双向电泳的结果。二、方法:本实验室蛋白质常用的除杂方法主要有丙酮沉淀、TCA- 丙酮沉淀、2D-cLeanup-kit处理。丙酮沉淀:加入3-4倍体积的-20 C保存的丙酮沉淀大于1小时。 沉淀结束后使用13200rpm转速离心10min,去上清,将ep管置 于冰上晾干5min,后用水化液溶解。TCA-丙酮沉淀:使用含有10%TCA的丙酮溶液(100mL丙酮加入 10gTCA (三氯乙酸),也可加入0.07%的DTT),沉淀方法与丙酮 沉淀类似。最后离心获得的沉淀较丙酮沉淀难溶,可使用丙酮冲 洗沉淀样品,以除去残余的室温放置5min,待样品蛋白中的丙 酮挥发完毕,使用水化液溶解沉淀。TCA沉淀:使用100%TCA溶液(500gTCA加入227g水)吸取11.1ul 加入到100ul的样品中,沉淀过夜。之后离心取沉淀,务必使用 丙酮清洗沉淀数次,待样品稍微变干时使用水化液溶解蛋白。2D-cLean-up kit:去除Triton X-100和SDS等形成双向电泳 中低浓度高分子量微团
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