鸭肉双向电泳一 、溶液配制：1 裂解液：（猪肉，外文MS 2005年） extraction buffer 20ml7M urea 72010-360.06 = 8.4084g2M thiourea22010-376.12 = 3.0448g1%（w/v）DTT 1%20 = 0.2g 2%（w/v）CHAPS 2%20 = 0.4g40mM Tris 4010-32010-3121.14= 0.0969g5mM Pefabloc1mM EDTA（EDTA-2Na） 110-32010-3372.24 = 0.00744g0.8% carrier ampholytes 0.8%20 ml= 0.16ml 裂解液：（大弹涂鱼肝脏组织，中文生命科学仪器2009） extraction buffer 20ml7M urea 72010-360.06 = 8.4084g2M thiourea 22010-376.12 = 3.0448g4%（w/v）CHAPS 4%20 = 0.8g40mM Tris 4010-32010-3121.14= 0.0969g用前每ml加 0.01gDTT 0.01g/ml10L TBP 10L/ml5L两性电解质 5L/ml10L PMSF 10L/ml2L EDTA 2L/ml10L亮肽素 10L/ml10L抑肽素 10L/ml2 水化液：（猪肉，外文MS 2005年） 20ml7M urea 72010-360.06 = 8.4084g2M thiourea 22010-376.12 = 3.0448g2%（w/v）CHAPS 2%20 = 0.4g5mM Pefabloc 0.2%（w/v）DTT 0.2%20 = 0.04g0.2% carrier ampholytes 0.2%20 = 0.04ml 水化液：（大弹涂鱼肝脏组织，中文生命科学仪器2009） 20ml7M urea 72010-360.06 = 8.4084g2M thiourea 22010-376.12 = 3.0448g4%（w/v）CHAPS 4%20 = 0.8g 65mmol/ L DTT 6510-32010-3154.25= 0.2005g0.001% 溴酚蓝 0.001%20 = 0.0002g0.2% carrier ampholytes 0.2%20 = 0.04ml水化液：双向电泳实验指南 50ml 8M urea 85010-360.06= 24g 4%CHAPS 4%50 = 2g 0.0002%溴酚蓝 0.0002%50 = 0.0001g 0.2%Carrier Ampholytes 0.2%50 = 0.1ml（使用前加）50mM DTT 5010-35010-3154.25 = 0.3856g二 、样品制备： 猪肉：50mg+1ml EB 在Eppendorf管中，用Retsch MM2 agitator 仪器4下匀浆1h。提取物在10000g，10下离心1h。收集上清液，测定浓度。 大弹涂鱼肝脏组织：取出大弹涂鱼肝脏组织，放入加有液氮的陶瓷研钵中，研磨成粉末状；快速称取0.2 g与1 ml的裂解液混合，震荡混匀，4 静置2 -3 h，静置期间每半小时颠倒混匀一次。12000 r/ min 离心40 min，取上清液；再15000 r/ min 离心60 min，取上清液。三、上样量 分析型：100ug 总上样体积350ul，150ul样品，200ul水化液 样品与胶条接触1小时后，加上矿物油覆盖胶条。四、 水化主动溶胀五、等电聚焦 有三种升压模式：快速、线性和慢速 采用何种升压模式由IPG胶条、溶胀缓冲液和样品的共同电阻决定。猪肉：电压逐渐升高到10000V，直至达到总的60000V.h。大弹涂鱼肝脏组织：50 V 主动水化14 h250 V线性除盐1.5 h500 V线性除盐1.5 h4500 V线性升压6 h4500V 快速聚焦25000 V-hr500 V 保持等电聚焦后的胶条可在-20长期保存，不会影响最终的双向电泳凝胶图像六 平衡： 平衡母液： 100ml6M urea 610010-360.06 = 36g 20%（v/v） glycerol （甘油） 20%100 = 20ml 2% (w/v) SDS 2%100 = 2g 50mM Tris 5010-310010-3121.14 = 0.6057g 平衡液：1% （w/v）DTT 还原蛋白巯基，使用前现配，10ml加200mgDTT。终浓度2%。平衡液：2.5%（w/v） 碘乙酰胺 巯基烷基化，加入碘乙酰胺，10ml加250mg。 终浓度2.5% 每个槽中放入一根胶条，胶面朝上。向槽中注满用平衡母液配置的平衡液进行反应。首先，DTT平衡液中摇荡10min，弃掉平衡液；然后，注入碘乙酰胺平衡液同样平衡10min，平衡过后取出IPG胶条。17cm的胶条4.5ml七 SDS-PAGE 电泳 按照IPG胶条电极与电泳槽电极相一致的原则，将平衡好的胶条，放置在凝胶上，用预溶的0.5%低熔点琼脂糖封胶，轻压IPG胶条，使其与SDS凝胶充分接触，排除其间小空泡，在室温中静置，直到低熔点琼脂糖凝固。将凝胶转移到电泳槽中，加入缓冲液，设置电泳运行条件：起始电压80V，30min；待样品走出IPG胶条在凝胶中浓缩成一条线后加到150V，3h；温度：恒温20。八 染色和脱色 考马2h，脱色过夜九 凝胶图像采用GS-800 扫描仪扫描，PDQuest7.4.0 图像分析软件进行分析, 进行蛋白斑点检测, 凝胶匹配, 根据Normalized Volume值的变化来判断蛋白斑点表达量的变化。