实验一 还原糖和总糖含量的测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）一目的1. 掌握还原糖定量测定的基本原理；2. 学习比色定糖法的基本操作；3. 熟悉分光光度计的使用方法。二原理在碱性的条件下，还原糖与 3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5- 硝基水杨酸（棕红色物质）,还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系， 在 540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别样品中还原糖 和总糖的含量。三仪器.试剂和材料1.仪器：（1） 25ml刻度试管（2）玻璃漏斗（3）三角瓶（4） 100ml容量瓶3个（5）刻度吸管（1ml,2ml,3ml）（6）恒温水浴（7）沸水浴（8）电子天平（9）分光光度计2. 试剂；（ 1） 1mg/ml 葡萄糖标准液 （ 2） 3,5-二硝基水杨酸试剂 （ 3）碘碘化钾溶液 （ 4）酚 酞指示剂 （5） 6ml/L HCI （6） 6ml/L NaOH3. 材料：食用面粉 四操作步骤1. 制作葡萄糖标准曲线：取 7 支 25ml 刻度试管，编号，按如下操作。操作项目管号0123456葡萄糖标准液（ml）00.20.40.60.81.01.2蒸馏水（ml）21.81.61.41.210.83,5-二硝基水杨酸（ml）1.51.51.51.51.51.51.5吸光度（A5400.0000.0810.2170.3310.4670.5750.648将各管摇匀，在沸水中加热5min,取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以 蒸馏水定容至25min,用试管塞塞住试管口，颠倒混匀。在540nm波长下，用0号试管调 零，分别读取16号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄样毫克数为横坐标，绘制标准曲 线。葡萄糖标准曲线葡萄糖毫克数（mg）2. 样品中还原糖和总糖含量的测定（1）样品中还原糖的提取：准确称取3g使用面粉，放在100ml三角瓶中，先以少量蒸 馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50C恒温水中保温20min,使还原糖浸出。 过滤，用20ml蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（2）样品中总糖的水解和提取：准确称取1g使用面粉。放在100ml的三角瓶中，加入 10ml 6mol/L HCI及15ml蒸馏水，置于水浴中加热水解30min。待三角瓶中水解液冷却后， 加入 1 滴酚酞指示剂。以 6mol/LNaOH 中和至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶 及滤纸，将滤纸全部收集砸100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取10ml 定容过的水解液，移入另一 100ml的容量瓶中，以水稀释定容，混匀，作为总糖待测液。（3）显色和比色，取4支25ml刻度试管，编号，按下表的量操作。操作项目还原糖测定管号总糖测定管号0）III还原糖待测液（ml）1100总糖待测液（ml）0011蒸馏水（ml）00113,5-二硝基水杨酸（ml）1.51.51.51.5吸光度（A540）0.3030.2980.4100.414吸光度（A540）平均值0.3010.421五、注意事项：标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。六、结果处理（1）由管、吸光度平均值在葡萄糖标准曲线查出相应的还原糖毫克数为：0.167mg由管I、II吸光度平均值在葡萄糖标准曲线查出相应的还原糖毫克数为：0235mg（2）计算样品中还原糖和总糖的百分含量如下：还原糖 =0.557 %总糖 =0.235 %七、问题讨论1.面粉中主要含有何种糖？答：淀粉2糖含量定量测定的方法还有哪些？答：高效液相色谱法（HPLC）苯酚-硫酸法蒽酮法双折射现象葡萄糖标准曲线葡萄糖毫克数（mg）幻想著