中央民族大学生命与环境科学学院分子生物学综合性设计实验报告小麦钙依赖型蛋白激酶ZmCPK11（CDPK）基因的克隆、表达载体构建及蛋白表达 姓 名： 姚建 学 号： 0941021 年 级： 09级 专 业： 生物科学 指导教师： 徐小静 2012年5月13日小麦钙依赖型蛋白激酶ZmCPK11（CDPK）基因的克隆、表达载体构建及蛋白表达摘要：目的：学习并掌握完整的DNA重组技术，设计实验实现从DNA到蛋白质的转化。方法：本实验运用生物信息学的方法，利用Genbank查找基因序列，利用DNAman查找酶切位点，并设计引物，从小麦中提取RNA，RT-PCR扩增之后测序检验基因序列的正确性，并构建基因表达载体，将载体转入受体细胞大肠杆菌，表达出蛋白，用SDS-PAGE分离蛋白，并用亲和层析法纯化蛋白质最后用免疫印迹鉴定蛋白。结果：得到表达小麦钙依赖型蛋白激酶的大肠杆菌，并分离得到钙依赖型蛋白激酶。结论：实现了基因的克隆及从DNA到蛋白质的转化过程。关键字：小麦钙依赖型蛋白激酶；克隆；表达载体构建；蛋白表达纯化前言在植物细胞中, 钙离子作为第二信使, 通过钙依赖蛋白激酶( CDPKs) 发挥功能是其传递信号的主要途径之一。CDPKs 广泛存在于植物体内, 是目前植物体内研究最深入的蛋白激酶。在植物体内, CDPKs 广泛分布于根、茎、叶、花和种子中, 在分生细胞、木质部细胞、叶肉细胞、花粉细胞、保卫细胞和胚细胞中。CDPKs 具有三个功能区, 从N 端到C 端依次为催化区、连接区和调控区。催化区由300 多个氨基酸组成, 具有典型的Ser/Thr 蛋白激酶的亚结构域, 催化区结构域的同源性较高, 一般在80% 以上。连接区由20 30 个氨基酸组成, 是蛋白激酶活性自抑制的区域, 也是最为保守的区域。在无Ca2+ 存在时, CDPKs 催化区可能与连接区结合, 使其激酶活性被抑制。调控区是钙结合区, 也是CDPKs 有别于其它类激酶的特有区域。此结构域与典型的CaM 序列的同源性大于40%。由于CDPKs 自身含有类似钙调素的序列, 因此其活性仅依赖于钙而不依赖于钙调素。有人甚至认为CDPKs 基因是由Ca2+ -CaM 依赖的蛋白激酶基因与CaM 基因融合而成, 这样有利于它更快地对Ca2+ 浓度变化作出反应。该区域是CDPKs 中最不保守的结构域, 大多数CDPKs 有4 个保守的EF 手性结构, 但有些CDPKs 却只有3 个EF 手性结构。CDPKs 的催化区前端, 即N 末端带有一段长短不一的序列, 称为可变结构域。各类CDPKs 在此结构域上很少有同源关系。许多CDPKs 与CaM 有一个共性, 即可与疏水的基质结合, 如苯基-Sepharose; polypropylaspartamide gel; 固定化的酚噻嗪等，根据此特点，我们可以利用亲和层析的方法分离纯化CDPK。一、实验原理1.利用GenBank查找基因序列，设计引物。2.提取总RNA，RT-PCR扩增该基因真核细胞绝大部分RNA为rRNA（主要为28S、18S、5.8S和5S四种）（占8085）、tRNA与小分子RNA（占1015）和mRNA（占15）。植物RNA的提取，主要包括以下4个步骤：用机械研磨等方法破碎植物组织细胞；加人蛋白质变性剂，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA；抑制内源和外源RNase活性；将RNA、DNA、蛋白质及其他细胞物质分开。现在已有多种较为成熟的分离总RNA的方法，其中3种最为常用，它们分别是苯酚法、胍盐法和氯化锂沉淀法。苯酚法是用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA。胍盐法是用异硫氰酸胍（或盐酸胍）和巯基乙醇变性蛋白并抑制RNase活性，经酚氯仿抽提后再沉淀RNA。氯化锂沉淀法是Li在一定pH下时使RNA沉淀。实验采用胍盐法。逆转录PCR（RT-PCR）包括逆转录（RT）和PCR两个基本过程，逆转录是以mRNA为模板合成互补的cDNA（complement DNA）的过程；PCR是以逆转录得来的cDNA作为模板而进行的PCR过程。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR中，cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。3.重组表达载体的构建将PCR扩增产物以及原核表达载体pET-30a 经Hind 、EcoRV双酶切后，以T4DNA连接酶连接，16 ，2h，转化受体菌DH5a，筛选重组子后，Hind 、EcoRV双酶切鉴定，筛选阳性克隆测序。4.转入大肠杆菌DH5a菌株中实验以大肠杆菌DH5a菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与重组质粒共保温，实现转化。由于pET-30a质粒带有卡那霉素抗性基因，可通过卡那霉素抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS质粒，则在含卡那霉素的培养基上不能生长。能在含卡那霉素培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了重组质粒。5.目的蛋白的诱导表达及分离纯化大肠杆菌中重组蛋白的表达主要有两种模式组成型及诱导型，主要由表达载体本身决定。在大肠杆菌中表达的外源蛋白对大肠杆菌本身的生长来说，多为有害的，因此，目前常用的都是诱导表达型载体，如pET系列。在大肠杆菌增殖阶段，外源蛋白不表达，然后改变培养条件，诱导外源蛋白表达。诱导条件也有多种，比如加入IPTG或者乳糖，或通过温度变化诱导表达。目前常用的多为IPTG诱导表达载体。DH5a诱导表达的菌液，经煮沸处理后，取上清，SDSPAGE分离目的蛋白。利用CDPK与疏水的基质结合的特点，使用苯基-Sepharose亲和层析柱，进行纯化。蛋白质免疫印迹可用于鉴定目的蛋白，主要由四个步骤组成，首先是蛋白质的凝胶电泳，然后将凝胶上的蛋白质转移到膜上固定，然后是抗原抗体免疫反应，最后是显色。因为抗原抗体反应往往受蛋白质空间结构差别的影响较小，主要与蛋白质氨基酸序列有关，所以凝胶电泳常采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。可以转移固定蛋白质的膜有多种类型，主要有硝酸纤维滤膜（NC膜）、尼龙膜和聚偏氟乙烯滤膜（PVDF膜）。硝酸纤维素膜是免疫印迹中应用最广的滤膜，尼龙膜与之相比优势在于它们可用不同抗体进行多次检测，但转移到尼龙膜上的蛋白质不仅没有合适的染色方法进行监测，而且抗体容易与滤膜非特异性结合，造成背景很高。PVDF膜与蛋白质的结合能力远高于硝酸纤维素膜，它常用于蛋白质的序列测定。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上后进行抗原抗体免疫反应。首先利用标准蛋白（常为脱脂奶粉或标准牛血清白蛋白）封闭膜上未结合蛋白质的位点，然后用已知的抗体作为一抗与膜上相关抗原反应，洗涤除去未结合的游离抗体后，再用带有显色标记的一抗的抗体（也就是二抗）再与一抗进行免疫反应，洗涤除去未反应的二抗后，就可以对膜进行显色鉴定。二抗上的显色标记一般为同位素或者酶，常用的为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，然后再加入相应酶的底物进行显色。Western免疫印迹可检测到ng级蛋白质的存在。二、实验用品1、实验材料小麦、原核表达载体pET-30a、T4 DNA Ligase和Ex Taq DNA聚合酶、以Hind 、EcoRV内切酶、大肠杆菌DH5a等2仪器设备高压灭菌锅、恒温摇床、超净工作台、分光光度计、冷冻高速离心机、恒温水浴锅、50 mL离心管、1.5 mL Eppendorf离心管、移液器及枪头、试管、培养皿、碎冰、超低温冰箱、水平电泳槽、电泳仪、紫外检测仪、凝胶成像系统、PCR仪、0.2 mL PCR、管电炉（或10 mgmL 溶菌酶）、垂直板电泳槽、脱色摇床、转移电泳槽、培养皿（直径15 cm，10 cm每组各一个）、滤纸、硝酸纤维素膜（NC膜）、乳胶手套、平头镊子等。3试剂及溶液（参见实验讲义）三、实验步骤（一）利用GenBank查找基因序列，设计引物。1、NCBI查找ZmCPK11序列，结果如下：1 ccaatgcagc cggacccgag cgggaacgcc aatgcgaaga cgaaactgcc gcagctggtg 61 acggcgccgg ctccgtcgtc ggggcgtccg gcgtccgtgc ttccgtacaa gacggcgaac 121 gtgcgggacc actaccgcat cggcaagaaa ctggggcagg ggcagttcgg caccacgtac 181 cagtgcgtgg gcaaggcgga cggcgctgag tacgcatgca agtccatccc caagcgcaag 241 ctgctgtgcc gggaggacta cgaggacgtc taccgcgaga tccagatcat gcaccacctc 301 tccgagcacc ccaacgtcgt ccgcatccgc ggcgcctacg aggacgcgct cttcgtgcac 361 atcgtcatgg agctctgcgc cggcggcgag ctcttcgacc gcatcgtcgc caagggccac 421 tacagtgagc gcgcggctgc gaagctcatc aagaccattg tcggggtcgt ggagggatgt 481 cactcgctcg gcgtcatgca ccgggacctc aagccggaga attttctctt tgccagcacc 541 gccgaggaag ccccactcaa ggccactgac tttgggcttt ccatgttcta caagcccggt 601 gataaattct ctgatgtcgt tggaagtcca tactatgttg caccagaggt gcttcagaaa 661 tgctatggtc cagaagctga tgtgtggagc gcaggagtaa ttctgtacat tttgctttgt 721 ggtgtgcccc cgttttgggc agaaactgag gctggaatct tcaggcagat tctgcgaggc 781 aaacttgatt ttgaatctga accctggcct agtatttctg atagtgctaa ggatctggtc 841 tgcaatatgc ttacacggga tcctaaaaag agatttagtg ctcatgaggt tctctgtcac 901 gcatggattg ttgacgatgc cgtggcacct gataagcc