发酵法生产透明质酸透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种大分子的粘多糖,是一种由-D-N -乙酰氨基葡萄糖和-D-葡萄糖醛酸为结构单元,-1，4-糖苷键连接成的一种链状高分子粘多糖。其分子量在几十万到几百万之间，又称糖醛酸，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，为目前所公认的最佳保湿成分，在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。 透明质酸的提炼的方法有三种：组织提取，微生物发酵和化学合成。组织提取法和化学合成法的成本高，产量低，受原料资源限制，不能满足市场需求。而微生物发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，因此开发先进的微生物发酵法生产HA的技术十分必要。目前HA产业前景广阔，发酵法己成为HA生产的主流工艺，而发酵法生产HA的工艺仍需进一步完善。微生物产HA的研究可以追溯到上个世纪30年代，1937年，Kendall发现链球菌可以产生HA，后来发现主要是一些A群和C群链球菌，它们具有合成与代谢以HA为主要成分的荚膜的能力。随后很多人进行了大量的研究。研究结果证明某些种属链球菌在一定的环境条件下，能同化吸收葡萄糖或其他碳源，以代谢物形式产生HA。随后经过不断地选育菌种和优化工艺，借助现代深层发酵技术与设备，HA的微生物发酵法被建立和应用起来。目前多选用链球菌、乳酸球菌类等（因此以下均以链球菌举例说明）。日本用发酵法生产了HA制剂并对该产品做了大量的药效、毒理、药代动力学等非临床实验和临床实验。结果表明，发酵法生产的HA无局部及全身毒副作用、安全性高、疗效确切。发酵法生产透明质酸主要包括两部分：发酵部分和下游提取工艺部分。发酵法生产HA的质量主要取决于菌种、培养基和分离提纯工艺的选择。一.发酵部分：经过阅读与分析文献，我个人将发酵部分划分为以下几个模块：1.菌种的筛选 2.菌种的诱变3.培养基配方的优化4.菌株的最佳培养条件首先以链球菌制备HA的过程为例简单介绍一下发酵法生产透明质酸的基本流程：链球菌复苏培养后，用诱变剂诱变，挑出不溶血、不含HA酶的高产率菌株。进行稳定传代后增菌培养，所得的菌种即可作为生产菌株。放入发酵培养液后，在通风搅拌的情况下发酵40小时，对粘稠的发酵醪进行提纯分离等处理后得到分子量高、粘度大的HA。下面我将针对这几个模块分别做详细的叙述与分析。1. 菌种的筛选： 优良的微生物菌种是发酵工业的基础，得到这类产物的两个成功要素在于产生菌的选择和筛选方案的确定。以目的代谢物透明质酸为目标筛选出能产生它的菌种是前提，设计出科学合理的筛选方案是事关筛选工作成败的关键。菌种初筛方法必须快捷、简便、有效，才能一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生物淘汰掉，把少量有用的微生物筛选分离出来。经研究发现在牛鼻粘膜上分离到的HA产生菌种即乙型溶血性链球菌比较适合用来发酵。1.1筛选步骤：牛鼻粘膜-稀释分离涂平板-初筛菌株-复筛摇瓶发酵-发酵液离心-上清液乙醇沉淀-定性分析-获得目的菌株-斜面培养1.2 菌种筛选操作方法：1.2.1 初筛：将牛鼻黏膜用01蛋白胨溶液分成梯度涂于血琼脂平板，37，培养24h。观察各菌落在血平板上的溶血性和形态，用接种针挑起看其黏度。荚膜染色并镜检。1.2.2 荚膜染色抹片自然干燥，甲醇固定，以久贮的多色性美蓝液做简单染色。荚膜呈淡红色，菌体呈蓝色。菌落选择的依据：产生HA的菌落透明度很高，隆起，呈水滴状色泽近似蛋清。1.2.3 复筛发酵摇瓶中接人初筛疑似菌株，每株五瓶，在200 r/min、37下培养24h。取复筛发酵液100ml，离心4000 r/min，20min。上清液用三倍体积无水乙醇沉淀。沉淀物用红外吸收光谱作定性分析。1.2.4 红外吸收光谱法取HA 2mg，KBr压片，用IR一400红外分光光度计在40005000m-1范围内扫描。发酵液提取物的红外吸收图谱在3400 cm-1附近有强的OH伸缩振动的特征吸收，表明有多羟基结构；在2900 cm-1附近有CH2的伸缩振动，1620cm-1及1560cm-1附近有CO、CN的伸缩振动，表明存在着乙酰氨基结构；在1400cm-1和1320cm-1附近有COC的伸缩振动和OH的弯曲振动偶合产生的两个吸收峰，表明存在着糖醛酸上解离羧基结构和多糖羟基结构。上述结果提示筛选菌株的产物呈较典型的HA红外吸收图谱。1.2.5 测定通过测定各种物质的含量来判断筛选结果是否正确。(1)HA中葡萄糖醛酸含量的测定。参照硫酸-咔唑法进行测定。(2)菌体量的测定：采用紫外可见分光光度计法，将培养液稀释后，在660nm处测其OD值。(3)HA含量测定：采用Bitter-Muir氏法。以葡萄糖醛酸标准品为对照，测得样品溶液中葡萄糖醛酸的含量。由于葡萄糖醛酸的含量占整个产量的4838，因此测得葡萄糖醛酸的含量除以4838，再乘以稀释倍数就可以得到HA的产量。(4)葡萄糖含量测定：采用3，5-二硝基水杨酸法。(5)蛋白质含量：参照考马斯亮蓝法测蛋白质含量，以牛血清白蛋白(BSA)标准品做对照。(6)相对分子质量测定：采用粘度法。使用05-06mm的乌式粘度计，参比液为02molL氯化钠，测定温度30，三点外推出特性粘数，根据公式=3.6x10-4Mr的0.78次方，计算出产品的平均相对分子质量Mr。2. 菌种的诱变： 以链球菌为例，野生型的链球菌多会产生溶血素(Streptolysin)，溶血素混入成品HA，会使HA的品质降低。一般情况下不会超过2g/L，得到的HA分子量也很低,所以规模生产必须获得非溶血性的菌株。因此必须经过诱变等手段获得HA产量高、优良性状稳定的菌株。诱变菌种的常规方法是以紫外线和射线为诱变剂的物理诱变方法和化学试剂如亚硝基胍、硫酸二乙酯等。但化学诱变剂污染环境、操作不安全，有待改进。诱变工作中，应该尽量利用菌落可以鉴别的特性进行初筛，把初筛选得菌株用摇瓶方法测定，可提高工作效率。21 菌种诱变步骤菌种-平面培养-同步培养-制备菌液-诱变处理-中间培养-稀释涂平板-突变株分离-保藏及扩大试验22 菌种诱变操作方法221平面培养将筛选的菌种挑取一环接种到平板培养基上，37，培养1416h。222同步培养从平面培养基上菌落上挑取2-3环接种到盛有20ml培养基的250ml锥形瓶中，37振荡培养1416h。223制备菌液将菌液进行离心3500rmin，离心10min后弃上清。供紫外线诱变处理的菌体用生理盐水洗涤2次，重新悬浮于5ml生理盐水中，摇匀后倒人盛有45mi灭菌生理盐水并带玻璃珠的100ml锥形瓶中，振荡10min，调整细胞浓度至10ml。供NTG诱变处理的菌体用01mol/L，pH= 60磷酸盐缓冲液来代替生理盐水，其它同供紫外线诱变处理菌体的菌液制备。224诱变处理2.2.4.1紫外线诱变处理：紫外线诱变的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构的扭曲变形， 阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起菌株的突变或死亡。(l)预热紫外线：紫外灯功率15W，照射距离30 cm，照射前打开紫外灯预热20 min，使紫外线强度稳定。(2)加菌液：两套标明1min和2min的无菌培养皿，分别加入3ml菌液和磁力搅拌棒。(3)照射：将上述两套培养皿磁力搅拌器上，打开皿盖搅拌照射1min和2min。盖上皿盖关闭紫外灯。2.2.4.2NTG诱变处理：(1)NTG溶液的制备：用分析天平称取1mg NTG于无菌离心管中， 然后加入01 molL，pH6o磷酸缓冲液1ml，于暗处振荡溶解。(2)诱变处理：取4ml菌液加人上述离心管中，充分摇匀，立即置于37水浴振荡处30min(NTG处理终浓度100；gm1)后，离心收集菌体，将含NTG的上清液倒人浓NaOH溶液弃去，用无菌水洗涤菌体3次，以大量稀释法终止NTG的诱变作用，最后向离心管中加5ml无菌生理水。2.25中间培养中间培养对获得稳定的突变株是极其重要的，只有让诱变处理后的细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞经过数代繁殖，隐性的变异就会显现出来，才可得到纯的变异细胞。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离，就会出现变异和不变异的细胞同时存在于一个菌落的可能，形成混杂菌落，导致造成筛选结果的不稳定和将来菌株的退化。同时，通过中间培养还可使变异的细胞数量增多，便于检出。将1ml诱变育种处理洗涤过的菌液，加20m1种子培养基的250ml锥形瓶中，37振荡培养2 h。226稀释涂平板取经中间培养的菌悬液用10倍稀释法在无菌水中稀释法在无菌生理盐水中稀释。紫外线处理的菌液取三个稀释度各01ml涂布于平板培养基上。NTG处理的菌液取三个稀释度各0.1ml涂布于平板培养基上。俱37，培养24 h。227突变株分离在血琼脂平板上挑取不具溶血性的或溶血性较弱的菌株进行摇瓶发酵，或再经多次诱变和发酵直至利用紫外比色选到较高产量的菌株。228紫外吸收光谱法将HA配成500gml的水溶液，用紫外分光光度计在190-300nm范围内扫描。从发酵液中提取的粗品HA的紫外光谱在196nm处有特征吸收，同sigma标样的相同。并且随着HA含量的增加吸光度值也变大。表明利用其最大波长处紫外光谱分析可以作为衡量发酵液中HA含量多少的依据。这样做节省了劳动和时间，而不必对HA进行干燥和称量。省略了中间环节，减少了误差。sigma标样在2 57nm和280nm处紫外吸收分别为0150和0105；若发酵液中提取的精品HA在257nm和280nm处紫外吸收大于这两个值，则表明发酵液中提取的精品HA较sigma标样存在核酸和蛋白质等杂质。同时我查到资料发现北京化工大学开发了发酵法生产透明质酸的新工艺。透明质酸高产菌株的选育采用紫外线诱变、Y射线、快中子诱变技术对已有的出发菌株进行了选育，开发了用磁场辅助Y射线、快中子诱变技术，得到了透明质酸高产菌，透明质酸稳定产量40gL-65g/L。用发酵法生产透明质酸质量稳定，而且其原料为淀粉等糖类，原料易得，大大地降低了HA的生产成本，为HA的普及推广应用奠定了基础，该成果通过了化工部组织的国家级成果鉴定，结论为技术水平达到国际先进水平，透明质酸发酵水平达465gl，据文献查询，目前国际透明质酸发酵水平最高为65gL。3. 培养基配方的优化： 首先以链球菌的营养需求为例，通常在含血清、脑心浸液等培养基上菌体才能较好地生长但这类营养物质价格昂贵，大规模生产成本太高，所以通常以蛋白胨、酵母膏或浸小粉、牛肉浸膏等的复合氮源代替。另外，有研究表明在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸，可以提高HA的产率。国内外文献资料大多使用葡萄糖作为碳源也有用蔗糖、半乳糖等研究链球菌的利用情况。可见，良好的培养基是微生物发酵的基础，培养基品质的好坏对发酵生产起着至关重要的作用，生产HA发酵的培养基一般包括碳源、氮源、无机盐、维生素和其它生长因子。生产HA的培养基中最常用碳源为葡萄糖，其次为蔗糖、麦芽糖，是因为绝大多数微生物对单糖的利用速度要比双糖和多糖快。在氮源的选择上，培养基中添加复配的氮源比单一的氮源效果更好，因为复配的氮源能提供不网的生长因子进行置补，利于细胞生长。因此，菌株不一样，其最适的培养基可能不一样，需要根据试验鉴定，同时也结合考虑成本以及工业化