转基因原理、GMO检测原理及生物安全评价摘要 从技术原理和方法进展着手，综述了植物转基因的不同方法。植物基因转化方法主要包括载体介导 的转化和直接基因转移，着重阐述了植物转基因方法的机制以及各种方法的适用范围、应用实例和进展； 比较了相互的优缺点。并讨论了GMO生物安全评价的主要内容、常用的检测方法和近年来国内外有关生 物安全问题的研究进展。关键词 植物转基因；载体介导法；直接导入法；GMO;生物安全；检测方法Abstract In the thesis the different measures of piant gene transformation were summarized according to the t echnoiogy principie and met hod deveiopme nt, especiaiiy in expa tiating the mechanism and appiicabie range of the met hods, providing some exampies in appiica tion and deveiopme nt, and its advan tage and disadvan tage.And discussed GMO biological safety evaluation main content of commonly used detection methods and the recent research progress on biological safety of.早在20世纪70年代，人们就开始探索植物转基因研究。1970年，Morton等人关于钙盐处理大肠杆菌 即能吸收外来DNA的发现，奠定了磷酸钙诱导外源基因的高效转化。近几十年，随着高等植物的细胞培养、 组织分化和再生，以及基因重组技术发展日趋成熟，植物转基因技术应运而生。而随着现代生物技术的迅 速发展,生物安全问题逐渐成为国际社会关注的热点问题之一。一、植物转基因技术和方法概述1 载体介导法1.1 农杆菌介导法农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。它是利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens )的丁( i Tumer induce )质粒和发根农杆菌(Agrobaterium rhizogenis )的R( i Root induce )质粒上的1段T- DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中，T - DNA可以被转移到 植物细胞并插入到染色体基因中。1.2 病毒介导法病毒载体是最近新出现的一种用于植物转化的载体。植物病毒转基因系统是将外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞。目前正在研究发展的植物病毒载体系统有3种：t单链RNA植物病毒载体系统，是以单链RNA为模板经反转录酶作用合成双链的cDNA，将其克隆到质粒或粘粒载体上，把外源基因插入到病毒的cDNA部分，通过体外转录，将带有外源基因的病毒DNA感染并进入植物寄主细胞。Kozicl和Siegal于1984年首先应用 烟草脆裂病毒（TRV ）这种病毒载体系统。随后，研究比较充分的雀麦花叶病毒（BMV ）。有报道将人） -干扰素克隆到BMV的RNA3的cDNA中，经体外转录，与其他基因组RNA共感染烟草原生质体，）-干 扰素的mRNA累积水平和表达水平都比用CaMV35s启动子高5倍。1989年，Dawson用烟草花叶病毒（TMV ）载体系统表达了CAT基因，发现其表达率非常高。单链DNA植物病 毒载体系统，是由单链环状DNA分子组成，一般存在成对的2个病毒颗粒。这种二连基因组可以把外源 基因插入其中1种DNA上而不影响另1种DNA基因组的复制。Ugaki等利用小麦矮缩病毒（WDV ）的 基因组为基础构建了穿梭质粒，转到玉米胚乳原生质体中，检测到报告基因的表达。Hohn等则用玉米条纹病毒（MSV ）载体系统研究玉米转座子系统。双链DNA植物病毒载体系统，是 将其病毒基因组中对病毒繁殖非必需的1段核苷酸序列去掉，换上1小段外源DNA而不影响病毒基因组正 常包装。用这样重组的病毒载体感染植物细胞以获得外源基因的转移。目前研究和应用主要集中在花椰菜 花叶病毒（CaMV ），把二氢叶酸还原酶基因插入CaMV构建稳定重组病毒载体侵染芜菁后，使芜菁产生 氨甲喋哙的抗性。另外用原仓鼠金属硫基因的重组CaMV侵染植物，在感染的植物叶片中检测到。综上所 述，这类载体比较小，便于在实验中操作，而且这类载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细 胞，外源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。但是病毒载体的容量有限，不能包装大片段的外源 DNA 基因组，寄主范围窄，复制稳定性差，转录和复制机理复杂。故至今还没有确定的证据表明，植物病 毒是否可以整合进植物细胞的基因组中。有人认为转入的外源基因稳定遗传的可能性不大。因此，目前植 物病毒载体系统还未得到广泛使用，但它仍然是植物转化方面的一个重要领域。2、 DNA 直接导入法由于载体介导法所涉及的技术面广，操作要求高，而且比较繁琐，所以近年来DNA的直接导入法应用日益 普及。 DNA 直接导入法用得最多的植物材料是原生质体，另外还有植物器官分生组织、未成熟的胚、愈伤 组织、细胞、花粉等。DNA直接导入法一般使用大肠杆菌的质粒作为载体，也可以直接用外源DNA导入 植物细胞。DNA直接导入法可分为：化学物质诱导法、电激穿孔法、脂质体法等。 2.1化学物质诱导法现在用得最多的物质是聚乙二醇(polyetlcyleneglycol , PEG ),它能与原生质体融合， 影响原生质体膜的通透性，致使原生质体较好地吸收外源DNAPEG通过电荷之间的相互作用，与DNA形 成紧密复合物，植物细胞通过内吞作用吸收这些复合物。一般PEG浓度较低时，不对原生质体造成伤害， 而获得的转基因植株来自同1 个细胞，避免了产生嵌合转化体，转化稳定性和重复性好，但对原生质体培 养和再生困难的植物难以利用，且转化率低，一般在10 - 5 10 - 6。这种方法首先用在模式植物烟草上， 转导象Ti质粒那样比较大的质粒。在添加PEG和外源DNA时，人们已成功地将外源基因整合到原生质体 基因组，并得到表达。利用原生质体的全能性，目前此种方法已在多种禾谷类作物如水稻、大麦、玉米及 一些双子叶植物中获得了转基因植株。2.2 电激穿孔法电激穿孔法是20 世纪80 年代初发展起来的一种遗传转化技术。植物细胞膜在外界高压电 脉冲下会造成非对称穿孔，这种在细胞膜上出现的短暂可逆性开放小孔，为外源基因提供了通道， DNA 分 子有可能通过小孔进入细胞内并整合到受体细胞的基因组上，但细胞本身的生理活动受到的影响不大。由 于质膜具有可修复性，外加电压造成的膜穿孔在一定时间内可以自动修复，使细胞恢复到正常生理状况。1985年，Michael等人首次利用高压脉冲(1 400 V )处理使细胞质膜产生可修复的穿孔，从而将外源基 因转入植物细胞，并在受处理的原生质体培养24 c后，检测到外源基因的瞬时表达。自此，电激穿孔法 先后在烟草、玉米、水稻、马铃薯、番茄、大豆、小麦等作物原生质体上获得成功。1986年，Morikawa等 人进一步用带壁植物细胞或组织，同样实现了外源基因的转移，使受体范围进一步扩大。2.3 脂质体法脂质体法是近年来才建立的一种转化技术，就是将包含外源基因的带负电荷的脂质体与植物 原生质体融合，从而达到转基因的目的。 Gregoriacis 利用脂质体介导生物大分子进入动物细胞。至今，脂 质体介导法已成为动物细胞转化最为有效的手段。 Cassells 用脂质体成功地将双乙酸荧光素分子导入到番 茄原生质体中。直到Deshayes等用脂质体介导法将带有NPTi基因的质粒PLGVneo转化烟草叶肉原生质 体，这是第1 篇用脂质体介导转化植物原生质体，实现稳定转化的成功报道。随后，朱祯等用转化脂将含 有NPTi的质粒plG3031导入水稻原生质体，获得外源基因在水稻细胞中正确表达的转基因植株。表明脂质 体介导法有着广泛的发展前景。脂质体法一般分4 个步骤，即原生质体分离和纯化，脂质体的制备，原生 质体和脂质体的融合以及转化体的培养、筛选和鉴定。通常用作脂质体转化的受体主要是原生质体，而对 于原生质体培养比较困难的植物2.4 其他方法除上述的一些主要方法外，还有离子束介导法、超声波介导法、激光微束穿孔法、萌发种子 的电泳法、花粉管和种子浸泡法等。它们各有其优缺点及适用范围，对于特定的植物或在一定的条件下被 证明是有效的。例如，1996年，程备久等用A叶注入将比克氏棉和红麻DNA导入泗棉2号；王兰岚、傅 荣昭用YCAG激光仪转化小麦京花1号获得经NPT!酶活性分析及PCR -Southern检测的转基因植株。1994 年，许宁等利用超声波的空化作用诱导小麦幼胚获得外源基因转移。 1993年，罗建沅利用种子浸泡 吸涨以获得转基因酸浆植株。 1991 年，黄力全等用激光微束技术将外源基因导入水稻悬浮培养细胞取得 成功。 1990 年，章力健用超声波将外源基因直接导入小麦幼穗愈伤组织和烟草叶片获得转基因植株。二、GMO检测原理1目的基因在GMO内表达的检测1 . 1目的基因整合到受体植物的确认对GMO进行生物安全检测，首先必须进行转基因植物的鉴定，即了 解目的基因是否已整合到受体植物,该基因在新的遗传环境下能否表达,其表达的时空分异规律,表达的稳定 性。第二步是GMO的效果检测，如转入抗虫基因的植物是否抗虫，转入耐除草剂基因的植物是否抗除草剂， 转入改善品质基因的植物是否改善了产品的品质。第三步才是真正意义上的生物安全评价,包括两个方面的 内容，一方面是GMO对生态环境的影响，包括对近缘野生种的影响，对非靶标生物的影响，GMO植株及残渣 对土壤微生物区系和下一季作物的影响;另一方面是对人类健康的影响。这一系列的检测,涉及到许多相应的 方法。转基因植物的鉴定方法有很多。根据检测的基因功能来划分,可分为调控基因（包括启动子、终止子等） 检测法、标记基因检测法及目的基因直接检测法。根据检测水平的不同区分，有DNA检测法、RNA检测法 和蛋白质检测法。 DNA 检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因中,而后两种方法检测到的是 外源基因是否能在受体中表达。根据检测所用的具体方法划分，有PCR检测法、Southern杂交、Northern杂交、Western杂交、化学组织检测法、生物测定检测法、免疫技术（酶联免疫吸附法EL ISA、免疫荧光） 等。目的基因整合到受体植物的确认一般利用分子检测进行。转基因植物的分子检测主要包括分子 标记和分子杂交。目的基因整合到受体植物的确认还可通过化学组织检测法和生物测定检测法进行。将转 基因植物种植在含抗生素（新霉素） 的培养基上,若能存活,则说明有抗生素基因（一般用作标记基因） 转入;而移入含葡萄糖的培养基上，如发生颜色反应（出现兰色），则证明有B2葡糖苷酸酶（GUS）报告基因存在。以 上两种情况都说明有外源基因转入。分子标记常用的方法有RFL P , PCR , RAPD ,SSR ,AFL P等。分子 杂交有Southern杂交、North2 ern杂交、Western杂交。杂交原理是根据外源基因碱基同源性配对进行 的,与外源基因探针杂交后能产生杂交带的为转基因植物。 Southern 杂交是将外源基因序列作为探针与转 基因植物的总DNA进行杂交，它是DNA水平上的分子鉴定方法。Northern杂交是将外源基因序列作为探针 与转基因植物的RNA进行杂交,是在转录水平上的分子鉴定方法。Western杂交是在翻译水平或蛋白质水 平上的分子鉴定方法。12 目的基因表达的确认 目的基因表达的检测就是要对其表达的