桑叶成分测定方法茶多酚的测定(GB/T 8313-2002)本标准适用于茶叶中茶多酚的测定，不适用于茶叶提取物制品中茶多酚的测 定。引用标准：GB/T 8302-2002茶取样；GB/T 8312-2002茶咖啡碱测定；GB/T 8303-2002 茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定；茶多酚(tea polyphenols)：茶叶水浸出物中与亚铁离子产生络合反应的酚类 物质。原理：茶叶中多酚类物质能与与亚铁离子形成紫蓝色络合物。用分光光度法 测定其含量。设备：分析天平、分光光度计。试剂和溶液：水为蒸馏水。1、酒石酸亚铁溶液:称取1g唯确至0.0001g)硫酸亚铁和5g (准确至0.0001g) 酒石酸钾钠，用水溶解并定容至1L(溶液应避光，低温保存，有效期一个月)。2、pH7.5磷酸盐缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠：称取23.9g十二水磷酸氢二钾钠，加水溶解后定容至 1L。1/15mol/L磷酸二氢钾：称取经110度烘干2h的磷酸二氢钾9.08g，加水溶 解后定容至 1L。取上述磷酸氢二钠溶液85ml和磷酸二氢钾溶液15ml混合均匀。操作方法1 取样：按茶 取样的规定取样。2 试样的制备：按茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定 GB/T8303-2002的规定，制备试样。3 测定步骤：(1) 试液的制备：按茶水浸出物测定GB/T 8312-2002中的11.1的规定， 制备试液。(2) 测定：准确吸取上述试液1mL,注入25mL的容量瓶中，加水4mL和 酒石酸亚铁溶液5mL,充分混合，再加pH7.5的缓冲液至刻度，用10mm比色 杯，在波长540nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度(A)。4、结果计算：计算方法和公式 茶叶中茶多酚的含量，以干态质量百分率表示，按下式计算：茶多酚()=【(Ax1957x2)/1000】x【L1/(L2xM0xm) x100式中：L1试液的总量，mL； L2测定时的用液量，mL；M0试样的质量，g; m试样干物质含量百分率，%;A试样的吸光度；1.957用10mm比色杯，当吸光度等于0.50时， 每毫升茶汤中含茶多酚相当于1.957mg。5、如果符合重复性的要求，则取两次测定的算术平均值作为结果。 重复性同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.5g。茶游离氨基酸总量的测定(GB/T 8314-2002)本标准适用于茶叶中游离氨基酸总量的测定。引用标准：GB/T 8302-2002茶取样；GB/T 8312-2002茶咖啡碱测定；GB/T 8303-2002 茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定；GB/T 8313-2002 茶茶多酚测定定义：游离氨基酸free amino acids：茶叶水浸出物中呈游离状态存在的具有a-氨基 的有机酸。原理：a-氨基酸在ph8.0条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光 度法在特定波长下测定其含量。仪器和用具：分析天平；分光光度仪。 试剂和溶液：所用试剂应为分析纯，纯度不低于 99%，水为蒸馏水。1、pH8.0磷酸盐缓冲液：1/15mol/L 磷酸氢二钠：称取 23.9g 十二水磷酸氢二钾钠，加水溶解后定容 至 1L。1/15mol/L磷酸二氢钾：称取经110度烘干2h的磷酸二氢钾9.08g，加水溶 解后定容至 1L。取上述磷酸氢二钠溶液95ml和磷酸二氢钾溶液5ml混合均匀。2、2%茚三酮溶液：称取水合茚三酮2g,加50ml水和80mg二水合氯化亚锡搅拌均匀。分次加 少量水溶液，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水定容至 100ml。3、茶氨酸或谷氨酸标准液：称取100mg茶氨酸或谷氨酸溶于100ml水中，作为标准吸取5ml母液，加 水定容50ml作为工作液(1ml含茶氨酸或谷氨酸0.1mg)。操作方法：1、取样： GB/T 8302-20022、试样制备： GB/T 8303-20023、测定步骤：3.1 试液的制备： GB/T 8312-2002中11.1的规定。3.2 测定：准确吸取试液（3.1） 1ml，注入25ml的容量瓶中，加0.5ml pH8.0磷酸 盐缓冲液和0.5ml 2%茚三酮溶液，在沸水中加热15min。待冷却后加水定容 至25ml。放置10min后，用5mm比色杯在570nm处，以试剂空白溶液作 参比，测定吸光度 A。3.3 氨基酸标准曲线的制作：分别吸取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml茶或谷氨酸工作液于一组25ml 容量瓶中，各加水4ml，pH8.0磷酸盐缓冲液0.5ml和2%茚三酮溶液0.5ml, 在沸水中加热15min。待冷却后加水定容至25ml。放置10min后，用5mm 比色杯在570nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度A。将测得的吸光度与对应的茶或谷基酸浓度绘制标准曲线。4、结果计算：计算方法和公式 茶叶中游离氨基酸含量，以干态质量分数表示，按下式计算：游离氨基酸总量（以茶氨酸或谷氨酸计）=【（C/1000）x（ L1/L2）】/【M0xm）】 x100式中：L1试液总量，mL； L2测定用试液量，mL；M0试样的质量，g； m试样干物质含量百分率，%；C根据测定吸光度从标准曲线上查的的茶氨酸或谷氨酸的毫克数。5、重复性：同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.1g。采用比色法测定茶叶中游离氨基酸总量，测定原理为：氨基酸与水合茚三酮 共同加热被氧化分解产生CO、氨和比氨基酸少一个碳原子的醛，此时茚三酮被 还原。在弱酸性溶液中，还原茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合成蓝紫色化合物 茚二酮胺（DYDA）DYDA在570nm处有最大吸收。采用茚三酮比色法测定茶叶中游离氨基酸总量，确定以茶氨酸为标准的最佳 反应条件。结果表明，反应pH为8. 0，缓冲液和显色剂的用量为0. 5mL，沸 水浴加热15min,冷却10min后加水定容到25mL在最大吸收波长570nm处测定 吸光度。1试验方法1.1茶氨酸标准溶液的配制:准确称取10 0mg茶氨酸（纯度不低于99%）溶于100mL 水中，作为母液，准确吸取5mL母液，加水定容至50mL，作为工作液（1mL含茶 氨酸0. 1mg）； 2%茚三酮溶液配制：称取水合茚三酮（纯度不低于99%）2g，力加50mL 水和80mg氯化亚锡（SnC12H O）搅拌均匀，放在暗处，静置一昼夜，过滤后加水 定容至10 0mL。1.2样品处理：称取3g（精确到0. OOOlg）粉碎混合均匀过60目筛样品于500mL锥 形瓶中，加450mL煮沸蒸馏水，沸水浴锅中浸提45mi n,减压过滤至500mL容量 瓶中，残渣用热蒸馏水洗涤23次，冷却，定容。1.3显色条件的选择：配制不同浓度的茶氨酸标准溶液和不同pH的缓冲溶液。 反应体系：取一定体积的待测溶液+0.5 mLpH8. 0的磷酸盐缓冲液+0.5 mL 2茚 三酮的溶液，水浴加热，冷却蒸馏水定容至25mL，在570nm处测定吸光度。研 究不同pH、显色剂用量、加热时间和冷却时间对吸光度的影响。结论：PH8.0，显色剂的用量为0.5mL,:加热15min时有最大吸光值。桑叶中微量元素的测定1. 1 预处理 将桑叶洗净，在干燥箱中于60C干燥至恒重，粉碎，过60目筛。1. 2 样品处理精确称取桑叶2.0000g,置于坩埚，在电炉上低温炭化至无烟，固体表面有一层白 色状。然后转入马弗炉中，于500-550C条件下灰化5h,取出冷却1。1. 3 样品的消化样品用18mL浓HNO3消化24h，然后加入3皿1也02于电炉上加热30min,至HNO3分解完全，转入微波消解罐中，微波消解9min，取出。冷却后转移至50mL容量瓶， 用二次水定容，摇匀，过滤2 。1. 4 测定 将上述样品用原子吸收分光光度计分别测定K、Ca、Na、M g、Mn、Fe、Cu、 Zn、 Cr、 Pb、 Co、 Ni 12 种微量元素的含量。结果见表1。表1 桑叶中必须微量元素的含量元素 K Ca Na Mg Fe Mn Zn Ni Cu Co Cr Pb ug/g 31582 10817 202.25 3035 339.25 50.53 49.625 4.44 12.3 0.585 0.12 -桑叶中富含人体必须的微量元素，种类较齐全，其中K、Ca、Mg含量丰富, 其他微量元素含量顺序为Fe Na Mn Zn Cu Ni Co。有害元素Cr, Pb均低于 国家限定标准。桑叶中总黄酮含量的测定2. 1 预处理 将桑叶洗净，在干燥箱中于60C干燥至恒重，粉碎，过60目筛。2. 2 超声波提取精确称取桑叶粉末2.0000g,经正交实验确定最佳提取条件为：用60%的乙醇，超 声波提取40min,料液比为1: 30,提取温度为50C3。2. 3 标准曲线的制作4精确称取芦丁标准品0.0053g,用60%乙醇溶解,定容至50mL,浓度为0.1075mg /mL。准确移取标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于10ml容量瓶中，分 别加入5% NANO2溶液0.3mL摇匀，放置6min,再加入10% Al( NO3)3溶液 0.3mL摇匀，放置6min,力叮mol/L NaOH溶液4mL，用60%乙醇定容，放置 15min。在510nm处测定吸光度，以溶液浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，得 回归方程为: C=0.2028A+ 0.0025, R2 = 0.9828。2. 4 样品的测定准确移取样品5mL两份置10mL容量瓶中，一份用60%乙醇定容，一份按标 准溶液测定操作，在510nm处测定吸光度，得A1、A2,则样品吸光度为A = A2 - A1。按标准曲线计算桑叶中的总黄酮含量。根据正交实验结果，用60%乙醇，以料液比1: 30,温度50e ,用超声波提取 40m in。测得桑叶中的黄酮类化合物的浸出率可达4. 13%。茶叶总黄酮含量的测定方法亚硝酸钠-硝酸铝法:精密称取105C下干燥恒重的芦丁纯品0.1000 g,用50%的乙 醇溶解，摇匀，定容至100 mL,再取10 mL此标准液于100 mL容量瓶中，稀释、 定容为0.1 g/L的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。分别吸取上述芦丁标准液0. 00，0. 25，0. 5，1. 0，2. 0，3. 0，4. 0，5. 0 mL于 10 mL比色管中，用50%乙醇 稀释至5.00 mL，分别加入5% ( g/L)NaNO2试液0.3 mL，摇匀，静置6 min。再加 5%( g/L)Al (NO3 ) 3 试液0.3 mL，摇匀，静置6 min，再加4% NaOH 4 mL，并用 50%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置12-15 min。于504-510nm处测试，以吸 光度值为纵坐标，以显色液中芦丁的质量(mg)为横坐标，用最小二乘法进行回归, 线性方程：Y = 4. 071 X10- 2 + 0. 1159X，相关系数r = 0. 9992。样品处理:茶叶碧螺春、铁观音建。准确称取1. 0000 g干燥并研碎的茶叶于锥形 瓶中，按1 ：70的固液比，加入50%乙醇溶液，80C水浴提取5 h。抽滤，茶汤转 移到100 mL的容量瓶中，50%乙醇溶液定容。分别按上述标准曲线的实验步骤 进行测定。食品中粗纤维的测定方法 GB 5009.10-85 Method for determination of crude fiber in foods 本标准适用于植物类食品中粗纤维含量的测定。1 原理：在硫酸作用