聚合酶链反应检测病原真菌及新生隐球菌的实验研究2009-11-15 顾菊林廖万清柴建华 【摘要】目的使临床系统性真菌病的诊断提高到分子水平。方法首先应用一对外侧的基于rDNA的真菌通用引物进行PCR扩增，此后应用新生隐球菌种特异性内侧引物对首轮扩增产物进行第二轮扩增鉴定。结果应用外侧引物对能对代表8属17种的25株医学重要真菌进行扩增，而对所有细菌和人DNA均为扩增阴性，内侧引物对仅对新生隐球菌获得扩增。应用两轮PCR扩增(通用PCR和随后的种特异性PCR)方法从获得临床标本到鉴定病原菌仅需8小时。结论这种依据PCR的检测和鉴定系统为临床快速诊断系统性真菌病提供了一种全新的实验方法并可望应用于临床。 【关键词】真菌病隐球菌，新型 Experimental study on detection of pathogenic fungi and cryptococcus neoformans by polymerase chain reactionGu Julin, Liao Wanqing, Chai Jianhua.Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003 【Abstract】ObjectiveThe objective of the study was to develop the diagnosis of systemic mycoses to the sphere of molecular biology. MethodsWith the nested-PCR methodology, a method for detecting fungal pathogens in clinical specimens was developed. The complete strategy consists of PCR amplification with the external fungal universal primers for rDNA and amplicon identification by the second cycle PCR amplification with the cryptococcus neoformans species-specific primer pair. ResultsThe external universal primers were capable of amplifying DNA from 25 strains representing 17 species (8 genera) of medically important fungi. Neither human nor a varity of pathogenic bacteria gave an amplified product. The internal species-specific primers amplified DNA only from Cryptococcus neoformans. The use of these two PCRs in tandem allows the detection (universal PCR) and identification (species-specific PCR) of a fungal pathogen within 8h from clinical specimens. ConclusionThis PCR-based detection and identification system provides a rapid laboratory method for the diagnosis of systemic mycoses and shows its potential for clinical applications. 【Key words】MycosesCryptococcus neoformans 医学上重要真菌传统上主要依据形态学和生理学等表型特征进行鉴定，但这些方法往往费时费力。由于近年来在AIDS、血液系统肿瘤以及移植等患者中由机会性真菌感染所致的发病率和死亡率呈日益上升的趋势，因而迫切要求发展鉴定病原真菌的新方法。对真菌菌种菌株进行遗传鉴定的分子方法为鉴定和检测病原菌提供了简便、快速和准确的方法。我们将聚合酶链反应技术用于病原真菌及新生隐球菌的检测，现将结果报告如下。 材料和方法 一、材料 (一) 菌株白念珠菌ATCC76615、067，类星型念珠菌C1，克柔念珠菌R5，高里念珠菌D10，热带念珠菌D9，乳酒念珠菌D12，光滑念珠菌C2，新生隐球菌D48、RV45981、RV59939、RV52642、RV45977，罗伦特隐球菌C3，黄曲霉C4，烟曲霉C5，产黄青霉C6，酿酒酵母C7，裴氏瓶霉C8，皮炎瓶霉C9，蓝色犁头霉030、057，少根根霉023、056由本院真菌室提供；脑膜炎奈瑟菌，结核分枝杆菌，大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎球菌，-溶血性链球菌，-溶血性链球菌由第二军医大学微生物学教研室赠送。 (二) 主要试剂和仪器Novozyme 234 (Novo Biolabs公司)，Lyticase (Sigma),Taq DNA聚合酶(GIBCO BRL)，PCR仪(PT-100，MJ Research)。 二、方法 (一) 菌株和细胞系DNA的制备真菌DNA制备采用高盐法1。细菌和人白细胞DNA的制备按文献进行2。 (二) 临床标本的预处理参照Buchman等3介绍的方法并作适当修改。 (三) PCR扩增参照文献4，5，我们在5.8 rDNA的附近选择了两对套式PCR引物。外侧的引物对ITS1-ITS4为预期的真菌通用引物对，序列为：ITS1 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，ITS4 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。内侧的引物对CN1-CN2设计为新生隐球菌种特异性引物对，序列为：CN1为5-ATCACCTTCCCACTA- ACACAT T-3，CN2为5-GAAGGGCATGCCT- GTTTGAGAG-3。首先使用外侧引物对进行PCR扩增(ITS-PCR)，作为套式PCR的第一轮反应。第二轮：以第一轮PCR的反应产物为模板用内侧引物对CN1-CN2进行第二轮扩增(CN-PCR)。 结果 一、ITS-PCR检测真菌DNA 所有用于本项研究的代表8个真菌菌属、17个真菌菌种的24株真菌DNA均扩增出单个的PCR产物，各菌种的PCR产物大小存在明显的多态性，绝大多数PCR产物大小为500650bp。7株细菌菌株DNA和4份人白细胞DNA则为扩增阴性。 二、ITS-PCR检测模拟临床血标本的敏感性 将在YEPD中生长的白念球菌ATCC76615连续稀释在健康人血中，模拟临床血标本进行PCR扩增。结果经PCR扩增最低可检出10CFU的真菌细胞(附图)，在不同日期重复实验，获得PCR检出水平约在510CFU范围内。 三、新生隐球菌种特异性引物的鉴定 5株不同血清型的新生隐球菌菌株DNA均扩增产生136bp的片断，与预期产物长度相符。而其 泳道1-4：白念珠菌CFU依次为103，102，10，1。泳道5，模拟标本中无白念珠菌；泳道6，无模板DNA(双蒸水)。泳道7为阳性对照，白念珠菌DNA。泳道M为核苷酸分子量标记pGEM-3Zf(+)/Hae 。 附图ITS-PCR检测模拟临床血标本的敏感性 它种的真菌和细菌以及人白细胞DNA均为扩增阴性。模拟临床标本的新生隐球菌检测，经CN-PCR扩增最低可检出15CFU的新生隐球菌。 四、临床标本的检测 对22例我室保藏的临床脑脊液及非脑脊液标本应用上述PCR方法进行了回顾性研究。结果表明，所有真菌镜检或培养阳性的10例标本ITS-PCR检测阳性；另有1例真菌培养阴性标本应用ITS-PCR亦获得了扩增。新生隐球菌种特异性CN-PCR检测结果表明，上述11例ITS-PCR扩增阳性的标本中仅有4例CN-PCR扩增阳性，而这4例标本此前经培养鉴定为新生隐球菌，其余18例新生隐球菌镜检或培养阴性的标本均未获得扩增。