红芸豆红细胞凝集素单体的别离纯化和性质研究【摘要】目的研究一种从红芸豆中提取红细胞凝集素单体(PHA-E)的新方法。方法红芸豆经过浸提，离子交换树脂别离，分子筛层析纯化后得到PHA-E样品。采用电泳法测定其纯度、分子量和等电点。用2%人细胞悬液测定样品凝集红细胞的才能和影响凝血的因素，使用硫酸苯酚法测定其糖含量。结果经PAGE分析PHA-E样品为单带电泳纯，SDS-PAGE上显示亚基分子量为32kD，等电点为6.5.样品使人红细胞50%凝集的蛋白质最低浓度为4g/l左右。单糖不影响PHA-E凝血活力，EDTA抑制其凝血活力，Zn2+促进其凝血。糖含量为8.1%.【关键词】红细胞凝集素别离纯化凝血性质研究PurifiatinandPartialharaterizatinfErythrheagglutininfrPhaselusVulgarisHETa1,ZHANGTa2*,Uhang-ying1,ANGLiang1,SHANXia-xue1,LUQin1(ShlfPrelinialediine,hengduedialllege,1.2022sBitehnlgy,2.Bitehnlgylabratry,hengdu,610083,hina)Abstrat：bjetiveTstudyaneethdfrErythrheagglutininPHA-EprdutinfrPhaselusvulgaris.ethdsPHA-EaspurifiedfrtheexellentseedsfPhaselusvulgarisbyextratin，inexhangehratgraphyandfinalgelfiltratinhratgraphy.Thepurity,theleularEightandtheiseletripintfpurifiedPHA-Eeredeterinedbyeletrphresis.Theabilityandtheinflueningfatrfagglutinatineredeterinedby2%erythrytesfhuan.nlusinThepurifiedPHA-EassinglePAGEutlineandhadapparentsubunitleulareightsf32kDbySDS-plyarylaidegeleletrphresis.IseletripintfthePHA-Eas6.5.PHA-Eanprteagglutinatinfhuanerythrytesat4g/l,butitsativityasntinhibitedbyanynsaharide.EDTAaninhibittheabilityfagglutinatin,andZn2+anaelerateit.ThesugarntentfPHA-Eas8.1%.Keyrds:erythrheagglutinin；separatinandpurifiatin；haeagglutinatin；haraterizatin植物凝集素(PhytheagglutininPHA)是从豆科植物种子中提取的一种含糖蛋白质1。植物凝集素具有刺激外周血淋巴细胞RNA合成和有丝分裂2，促进免疫反响，使细胞凝聚，肿瘤细胞失活，以及诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子等生物学活性。文献3报道PHA是由E、L两种亚基组成的四聚体蛋白质的混合物，按其亚基组成可分为L4、L3E、L2E2、LE3、E4具有一样物化性质和不同生物学活性的同工凝集素。其中PHA-E含有4个一样的E亚基，具有最强的红细胞凝集功能，没有白细胞凝集才能。由于凝集素单体较混合物PHA对于糖链具有更加特异的识别才能，可以作为分子探针，研究特异细胞膜受体的分布等，在免疫学、肿瘤、生殖生理、细胞生物学等许多方面得到应用，在医学、农业上呈现出宏大的应用前景。关于红细胞凝集素单体的别离纯化国内还未见报道，本研究改良和优化前人的提取和纯化方法，简化操作程序，从红芸豆中得到了凝血活力较高的电泳纯红细胞凝集素单体。1材料与方法1.1仪器与试药UV1102紫外可见分光光度计上海天美科技，蛋白质纯化系统上海琪特仪器分析，高速冷冻离心机Eppendrf公司，INI-PRTEIN电泳系统Bi-Rad公司。红芸豆购自甘肃兰州，低分子量蛋白标准上海东风生物技术，蛋白质等电点标准Pharaia公司，两性电解质pH39，Pharaia公司，PHA-ESiga公司，DEAE-SepharseFF、-SepharseFF、SephadexG100Phararia公司，乙酰氨基葡萄糖Siga公司，人红细胞悬液由本实验室自制，其它试剂均为国产分析纯。1.2PHA-E提取过程1.2.1PHA-E粗提液制备将红芸豆粉碎，取100g粉末，参加1000l的NaA-HA缓冲液(pH5.2，20l/L,0.14l/LNal),分四次磁力搅拌浸龋合并浸取液，后用两层纱布过滤。搜集滤液，调pH5.2，在4下10000rp离心10in，取上清液，即得PHA-E粗提液。1.2.2-Sepharse层析取-Sepharse装柱(2.620)，用NaA-HA缓冲液pH5.2，20l/L平衡，将搜集的PHA-E粗提液上柱。用Na2HP4-NaH2P4缓冲液pH6.0，20l/L冲洗至没有蛋白质流出，再用Na2HP4-NaH2P4缓冲液pH7.2，20l/L洗脱，搜集蛋白质峰，调pH7.2.1.2.3DEAE-Sepharse层析取DEAE-Sepharse装柱(2.625)，用Na2HP4-NaH2P4缓冲液(pH7.2，20l/L)平衡，将1.2.2搜集得到的蛋白质峰上柱吸附，用缓冲液冲洗至基线平衡。用含00.4l/LNal的Na2HP4-NaH2P4缓冲液(pH7.2，20l/L)进展梯度洗脱，流速为5l/in，搜集活性峰，装入透析带中，4冰箱中PEG浓缩。1.2.4SephadexG100层析取1.2.3中的PEG浓缩液，上已经平衡好的SephadexG100层析柱(2.6100)，上样量为5l，用Na2HP4-NaH2P4缓冲液(pH7.2，20l/L)进展洗脱，流速为2l/in，搜集活性峰，用纯水透析除盐后，冻干，即得PHA-E单体。1.3分析方法及性质研究1.3.1凝血活力测定按照文献方法4在微量V型血凝板上进展，用生理盐水倍比稀释凝集素，每孔含稀释液40l，参加2%人红细胞悬液40l，振荡混合，在25下放置2h，肉眼观察结果，凝集活力以50%人红细胞凝集所需凝集素的g数表示。1.3.2PHA-E凝血活力影响因素测定依上法，参考文献5，6，PHA-E倍比稀释后，每空参加20l，同时参加20lEDTA、二价金属离子或单糖等待测物质溶液，37下孵育1h，用上述凝血活力测定方法进展评价。1.3.3蛋白质含量测定以牛血清白蛋白为标准，采用考马斯亮蓝G250测定方法7。1.3.4蛋白质亚基分子量测定参照文献8进展，使用不连续电泳SDS-PAGE，凝胶浓度为12.5%，pH8.3.考马斯亮蓝R-250染色。1.3.5蛋白质等电点的测定参照文献8进展，将样品和pH310等电点标准在pH39胶上进展电泳，经考马斯亮蓝R-250染色后，量取标准蛋白带和样品的泳动间隔 ，测定样品的等电点。1.3.6PHA-E纯度测定参照文献8进展，使用不变性电泳PAGE，用PHA-E标准品做对照，测定其纯度。1.3.7糖含量测定参考文献方法9，以苯酚硫酸法测定，以葡萄糖为参照物做标准曲线，求得值以0.9的系数修正。2结果与分析2.1PHA-E的提取文献3报道，PHA-E分子量为128kD，等电点为pI6.5.通过粗提取和-Sepharse层析，有效的除去了核酸和多数杂蛋白，将PHA-E主要集中在pH7.2的Na2HP4-NaH2P4缓冲液中。洗脱液上DEAE-Sepharse柱后，梯度洗脱获得2个峰见图1，其中蛋白质峰A具有较强凝血活力。搜集峰A，浓缩后进展分子筛层析，得到两个峰见图2，其中峰b具有凝血活力。搜集峰b，透析脱盐，冻干后得到白色粉末，即为PHA-E纯品。2.2凝血活力测定纯化得到的PHA-E产品，在微量V型血凝板上进展凝血活力测定。无凝集时红细胞沉于“V图1DEAE-Sepharse层析图Fig.1InexhangehratgraphyfPHA-EnDEAE-Sepharse图2SephadexG100层析图Fig.2GelfiltratinfPHA-EnSephadexG100型孔底部，呈一小圆点；凝集时红细胞互相聚集形成一片网络状，红细胞不下沉。不同的凝集程度用数字表示如下：(不凝集)：红细胞全部沉积于“V型孔底部，呈边缘明晰的小圆点；1(少许凝集)：沉积范围比半凝集大，未普及全孔；2(半凝集)：局部沉积中部，周围有浑浊带，约占孔面积的50%；3(大局部凝集)：少许沉积于孔中心，沉积点边缘模糊；4(全凝集)：红细胞互相聚集形成一片网络，红细胞不下沉。凝集效价的断定以“2作为终点。实验中PHA-E起始浓度为200g/l，倍比稀释得到200g/l0.75g/l浓度范围19号孔的样品，以生理盐水作为空白10号孔，PHA-E标准品为对照起始浓度为200g/l,凝血活力为8g/l，测得PHA-E的凝血活力为4g/l.实验结果见图3和表1.表1红细胞凝集结果示意图2.3凝血影响因素结果见表2，葡萄糖、半乳糖不影响PHA-E凝血活性，EDTA抑制其凝血，Zn2+促进凝血。其他二价金属离子对PHA-E凝血活力未见明显影响。表2EDTA、二价阳离子和单糖对PHA-E凝血活力的影响2.4电泳性质测定所得产品PHA-E在12.5%凝胶浓度的SDS-PAGE上表现为单带，分子量为32kD电泳位置与标准品PHA-E一致(见图4)。在PAGE上表现为单带，位置与标准品一致，结果见图5。在IEF上表现为两条带，主带位置为pI6.5，与标准品位置一致(见图6)。以上电泳分析证明，别离得到的产品PHA-E纯度到达电泳纯，电泳性质与标准品一致。3讨论植物血细胞凝集素PHA是由五种四聚体糖蛋白组成的混合物，组成的蛋白质等电点在5.46.5之间。其中PHA-E的等电点最低，为pI6.5。目前文献报道主要是通过亲和层析10，11、盐析和离子交换树脂结合12来进展凝集素的纯化。亲和层析提取PHA，然后再纯化得到各个单体，操作步骤虽然简单，但是亲和介质价格昂贵且重复使用率低，产品质量虽然很好，但是本钱较高。普通消费采用离子交换树脂法，本钱较低，但是在前处理阶段却需要盐析使蛋白质沉淀，而后透析脱盐，处理量大，步骤繁琐。本研究采用直接在阳离子交换层析柱上进展pH梯度的洗脱，在阴离子交换柱上进展盐浓度的洗脱。通过离子交换树脂的富集浓缩，到达了盐析法的效果，且纯化效果更好。离子交换层析处理上没有体积限制，也较传统方法更具备优势。产品经PAGE考马斯亮蓝R-250染色后得到单一的带，SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示一条分子量为32kD的带，IEF电泳经考马斯亮蓝R-250染色后得到样品等电点为6.5,说明别离得到的红芸豆凝集素具有较高的纯度且与标准品吻合。PHA-E样品在血凝活性检测中，能使5%人红细胞凝集的最低浓度约为4g/l.PHA-E具备单一的凝血活性，能特异性的识别特殊糖链，因此在免疫诊断方面较PHA更具优势，纯化的红细胞凝集素可作为糖专一性探针，研究癌变细胞膜糖链构造和细胞变异的工具。