植物次生代谢的细胞工程调节和基因工程调节摘要 ：对工业上利用植物细胞培养技术生产天然的植物成分即植物次生代谢产物进行了介绍,包括 植物细胞培养生产植物次生代谢物质的特点、研究方法、研究历史、研究现状以及基因工程在该领域的应 用和大规模工厂化生产的前景。关键词： 植物细胞培养;工业应用;次生代谢产物;工厂化生产植物细胞培养在工业上的应用主要是进行植物有效成分的生产和生物转化两个方面。笔 者主要介绍其中的一个方面,即进行植物有效成分的生产。植物不仅为我们人类的生存和发 展提供了必要的食物、纤维和建筑材料，同时也是香料、色素、医药及农用化学品等天然产 物的重要来源。许多年以来,植物天然产物的开发一直是人们研究的热点。然而这些物质在 植物体中的含量一般很少，直接从植物中提取不但浪费大量的植物材料，而且还可能造成一 些珍贵的植物种类的灭绝。例如为了获得抗癌药物紫杉醇原始的做法是从红豆杉的树皮中提 取。红豆杉生长缓慢，提取1 kg的紫杉醇需要1 000棵生长了 100年的红豆杉。如果延续这 种原始的做法红豆杉很快就会从地球上消失,而利用植物细胞培养的方法直接进行紫杉醇的 生产就可以解决这个问题。随着世界人口的急剧增长和人们对植物资源的掠夺性开发，很多 类似于红豆杉的珍贵植物资源已经灭绝或者正面临着灭绝的危机。利用植物细胞培养来生产 植物的天然成分正是为了解决这种生态危机并满足人们对植物产品需求的情况下发展起来， 它已经成为当今植物生物技术领域研究的热点课题之一。1 植物细胞培养技术的特点利用植物细胞的体外培养生产有价值的天然产物，较大田生产相比有如下优点：不受 地区、季节、土壤及有害生物的影响；代谢产物的生产完全在人工控制条件下进行，可以 通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超整株植物产量的代谢产物1, 2；有利于细胞 筛选、生物转化、寻找新的有效成分3；减少大量用于种植原料的农田，以便进行粮食作 物的生产46；有利于研究植物的代谢途径，还可以利用基因工程手段探索或创造新的合 成路线，得到新的有价值的物质。2 植物细胞培养生产天然产物的技术要点利用植物细胞培养进行植物次生代谢物质的生产，从选择合适的植物材料开始，每一步 骤都伴随着植物有效成分的检测选择合适的植物材料后需要在固体或半固体的培养基上建 立愈伤组织培养体系。此过程中一般为了提高次生代谢物质的产量，应选择合适的细胞系进 行细胞培养， 需要选择植物体不同的部位做外植体进行研究。建立了外植体的愈伤培养体系 后还需要如下的过程:对其进行继代培养至遗传性状稳定;选择合适的细胞培养方法对选择 好的细胞系进行细胞的培养试验，包括选择培养条件和对植物的天然成分的合成进行诱导等， 从而建立合适的培养方法;生物反应器中的大规模培养。以上仅是植物细胞培养生产天然产 物的大致的轮廓，每一个步骤中根据所选择的植物材料和培养目的可以做相关的变动，且每 一步骤中都包含着很多可供选择的具体方法。3 植物细胞培养生产天然产物的研究历史及现状利用植物的细胞培养进行植物有效成分的生产发展较晚。原因是人们一直认为未分化的 植物细胞（比如愈伤组织和悬浮的植物细胞）同分化的细胞和特殊的植物器官不同，不具有产 生次生代谢产物的能力。到20世纪70年代人们还看不到利用植物细胞培养进行天然产物生 产的潜力。目标代谢产物低（通常小于细胞干重的 1%），且植物细胞的生长缓慢是制约这一 技术发展的主要原因;此外，在当时植物细胞所特有的生理生化特征还没有被认知，人们单纯 地模拟培养微生物的条件来培养植物细胞也影响了该技术的发展 ;另外,当时有效成分的分 析手段的落后也限制了该领域的发展。20世纪70年代后,该技术开始有所发展,利用植物细胞培养生产一些药用有效成分已经 在工业上获得了成功。据20世纪80年代末期的统计表明,当时全世界有40 多种资源植物的 次生代谢细胞工程的研究获得成功,悬浮培养体系中次生代谢物质的产量达到或超过整株植 物的产量,研究达到中试水平。其中培养紫草细胞生产紫草宁的成功比较令人瞩目，1984年 日本的Mitsui石化公司利用紫草的细胞培养生产紫草宁，规模达到750 L,产物最终浓度达 到1 400 mg/L。20世纪90年代至今，利用植物细胞工程进行天然产物的生产进入了一个新 的发展阶段,它与基因工程、快速繁殖形成了三大主流7。20世纪90年代全世界已经有1 000多种植物被进行过细胞培养方面的研究8。利用植 物细胞培养生产的植物次生代谢产物包括药用成分、香料、色素、杀菌剂等,已经成功地培 养出了紫草宁、人参皂甙、紫杉醇、阿马里新等一系列的天然植物次生代谢物质。同时也探 索出了悬浮培养、固定化培养、两相培养、高密度培养以及与基因工程相结合的一系列培养 方法。目前, 利用植物细胞培养生产天然的植物成分主要致力于高产细胞株的筛选、悬浮培 养技术中培养条件的优化、细胞固定化培养以及利用基因工程手段培育高产细胞系等。这些方法究竟哪一个最好, 还很难下一个结论, 植物材料的多样性以及特定代谢产物对 培养条件的特殊要求决定了培养方法的多样性。一些学者认为将植物细胞固定到载体上的细 胞固定化培养同在生物反应器中进行的悬浮培养的植物细胞生长缓慢、不耐剪切力以及容易 聚集成团等相比有许多优点。推断可能是固定化培养在培养过程中形成的物理、化学剃度有 利于细胞的分化,从而有利于次生代谢物的积累。 Lindsey 等曾经利用细胞固定化技术培养 辣椒细胞，生产出比悬浮细胞高1000 多倍的辣椒素。很多报道表明固定化形成的截留有利 于次生代谢物的合成和积累，认为细胞固定化可能是提高植物次生代谢产物的一种好方法。 Gillet等在培养Nicotiana tabacum和Solanum ariculare细胞时用钙）藻酸盐凝胶颗粒做 载体进行细胞的固定化培养提高了东莨菪苷的产量。但是Stphane Charlet等用同样的方法 培养Solanum chrysotrichum细胞却没有达到提高螺甾烷皂甙产量的目的，固定化的细胞生 产螺甾烷的产量为5 mg/g（干细胞），远少于悬浮培养下螺甾烷的产量14 mg/g（干细胞）。由 此可以看出, 细胞固定化并不是适用于所有植物的细胞培养。胞固定化后诱导产物的释放也 是一个问题。现在有化学法（包括有机溶剂法、抗生素法、蛋白质、溶血卵磷脂、脱乙酰几 丁质、去污剂、螯合剂法等）、物理法（包括渗透压冲击、温度冲击、电处理、超声波处理、 激光打孔）以及pH扰动等方法。但是，这些方法又会使细胞膜受到一定的损伤，从而导致细胞 的活性降低，甚至死亡，从而失去了研究的意义9。为了提高植物次生代谢物质的产量，进行培养条件的优化是必须的。近几年在该研究领 域中植物细胞的高密度培养研究得较多。高密度培养中因为增加了糖的含量，其生物量通常 表现出成比例增加的趋势，但是次生代谢物并不是表现出相似的增长，并且随着细胞浓度的 增加，表观粘度也随之增大，传质、传氧等能力均会受到影响。但是，增加碳源可能对次生代 谢物质的积累有积极的影响。在培养Coleusblumei细胞时提咼蔗糖的含量有利于迷迭香叶 宁酸的积累；在培养Catharanthus rosus细胞培养时提高碳源的含量对阿马里新、利血平、 色胺的生成均有促进作用；在中国红豆杉悬浮培养细胞进行高密度培养时，明显地提高了生 物量，还提高了生物反应器中紫杉烷的含量10。另外，添加前体、用诱导子进行诱导等均有很 多成功的报道。植物细胞培养进行次生代谢物质的生产到目前虽然已经积累了一定的经验，但是还有太 多的地方值得我们进行深入的研究。4 基因工程在植物细胞培养中的应用以及大规模工厂化生产的前景近些年，基因工程的发展也促进了植物细胞工程的发展，利用植物细胞培养技术发展起 来的植物发根(hairy roo t)和冠瘿(shoo ty t era tomas, grown gall t issue)的培养来进行 植物天然产物的生产已经取得了另人瞩目的成就。直物的发根是发根农杆菌(Agrobac terium rhizogenes)的Ri质粒中的T-DNA插入宿主细胞的核基因组而得到的表现型。植物发根可以 在不添加植物激素的培养基中进行快速增殖，很多研究表明其生长速度和次生代谢物的产量 均超过不经基因转化的植物的细胞培养物。植物的冠瘿是根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒T-DNA插入到宿主的核基因组内得到的表现型。冠瘿也在不需添加 外源植物激素的情况下表现了良好的生长和合成植物次生代谢产物的能力。通过基因工程的 手段植物不但能提高自身的次生代谢产物的合成,而且还可以作为宿主有机体来生产重组蛋 白质，目前该领域已经成为一些学者研究的热点课题。植物细胞培养进行有效成分的生产发展到现在,已经取得了令人瞩目的成就。一些植物 的细胞培养已经完成了实验室阶段的研究,正向工厂中试过度,有的已经完成工厂化生产规 模的实验。但是,植物细胞在培养过程中的生长缓慢、不耐剪切力11、目标代谢产物含量低 等自身特点影响了其工业化生产的进程。目前该技术面临的最大问题就是如何降低其生产的 成本。充分利用基因工程的的手段,生产出次生代谢物产量高的细胞系;深入地研究特定代谢 产物的生物合成途径,对培养条件进行优化;研究和开发适合植物细胞培养的生物反应器是 解决这一问题的根本途径。随着这几方面研究的不断进步,植物细胞培养这种方兴未艾的技 术将在生产有价值的植物天然成分方面发挥越来越大的作用,将会有越来越多的天然植物成 分可以在工厂中进行大规模的发酵生产。参考文献1许建峰.高山红景天愈伤组织颗粒悬浮培养生产红景天甙动力学与过程调控:学位论文.大连:大连理 工大学,19962常钰,刘涤，胡之璧.植物细胞和器官大规模培养研究的进展.生物技术通讯,2001,1:31363郑光植.三七愈伤组织的培养.云南植物研究，1989,11 (3):2552624郑光植.植物次生代谢工程研究的新进展 :第六界国际植物组织与细胞培养会议评述 .植物生理学讯,1987, 2:75795郑光植.植物次生代谢细胞工程与资源开发利用.云南植物研究,1988(增刊):1251346顾静文.当归组织培养的研究.药学学报, 1982, 17(2):1311387朱西儒,雷光富.药用植物细胞培养代谢全能性及产物检测技术的研究进展.广西科学院学报, 1998,5 (14): 1 68周立刚,郑光植.生产次生物质的植物细胞大量培养.生物工程进展,1991,11(1):29349杨玉敏,元进英,胡宗定.植物细胞内产物释放行为的研究进展.生物工程进展,1998, 18(1):172110王红强,张蕴哲,陈旭峰,等.中国红豆杉悬浮细胞高密度培养.华东理工大学学报.1999,25(1): 55 5811俞俊棠,唐孝宣.生物工艺学.上海:华东理工大学出版社,1999,230