流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测3：HLA-B27测定4：CD55CD59测定5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4测定8：细胞周期分析9：活化血小板检测10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 淋巴细胞亚群测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0109/L之间。若10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD45/4/8/3 No. CD45/56/19/3 No. CD4/8/3 No.IM1650 同型对照IgG1/IgG1/IgG1 No.IM1672 CD3/19 No.IM1293 CD3/16+56 No.IM2076 CD19-PC5 No.IM2643Flow-Count荧光微球 No.) 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）6)需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机) 报告结果 报告百分数（和绝对值）操作性能 精密度 批内五次重复CV10.0109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 28 (CD3/HLA-DR No.IM1295 CD25-PC5 No.IM2646 CD3-FITC No.IM1281 CD45RA-PE No.IM1834 CD45RO-PE No.IM1307 CD4-PC5 No.IM2636 ） 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.) 液体 10ML 2-8(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV5-10%提示排斥、持续增加提示应作病理活检；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持