三种赤潮藻多克隆抗体制备及特异性分析* 瑞典国际基金资助项目，IFS/ grant SUI A/3864号。孙宁波，硕士，E-mail:sunningbo1221hotmail.com。通讯作者：隋正红 ，教授，suizhenghouc.edu.cn。收稿日期：2007年月日。 孙宁波 隋正红 包振民 王春燕 (中国海洋大学海洋生物遗传学与种质工程实验室, 青岛 266003)中国是全球受赤潮危害较重的国家之一（周名江等，2001），随着现代化工农业生产的迅猛发展，沿海地区人口的增多，大量工农业废水和生活污水排人海洋，导致近年来赤潮的频繁发生和规模的不断扩大，严重破坏了渔业资源和海产养殖业，并威胁着人类的生命安全。中国海岸线较长，引起赤潮爆发的藻种种类多样，赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、共生甲藻（Symbiodinium sp）、链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）等藻种是常见的赤潮藻，危害较为严重，也是目前研究较多的主要赤潮藻，如何及时、精确、快速地对赤潮藻进定性、定量分析对于预报赤潮的发生、以及赤潮的检测研究均有重要意义和参考价值。传统的赤潮藻定性、定量鉴定主要是通过光学显微镜方法(Hallegraeff et al.,1995)，此方法费时、费力，对一些个体微小的藻类难以做出准确鉴定（Rehnstam-holm,et al.,2002），因此发展新的检测技术成为赤潮研究的紧迫之需。Caron等(2003)用浮游金藻(Aureucoccusanophagefferens)成功制备出高特异性的单克隆抗体与多抗血清，并对两者进行了多方面的特性分析。Nakanishi等(1996)利用单克隆抗体制作免疫传感器定量研究Chatonell marina,可检测出10010000ind/ml密度。向军俭等（2003）制备了种赤潮藻单克隆抗体，以抗体为基础的免疫检测方法克服了人为因素的影响，具有定性和定量的准确度。本文作者制备了种不同粒径的赤潮藻-赤潮异弯藻、链状亚历山大藻、共生甲藻的多克隆抗体，采用间接酶联免疫法检测抗体的效价，采用竞争酶联免疫法检测多克隆抗体的特异性，为进一步的的开拓赤潮准确定性、定量检测提供依据，具有深远意义。 一、材料与方法1.实验材料赤潮异弯藻、链状亚历山大藻和共生甲藻藻株均分离自青岛胶州湾海域。种藻均采用f/2培养基（亓海刚等，2006）培养，温度为（201），光照强度为72mol/m2s，采用14h：10h (L/D)的光暗周期，所用新西兰纯种兔由青岛市药检所提供。2.实验方法）免疫原的制备将生长旺盛的藻细胞培养液用终浓度为2%的甲醛固定过夜，10000r/min，离心10min，收集藻细胞沉淀。藻细胞团块用蒸馏水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通过离心收集藻细胞，离心条件均为10000r/min，离心10min。将收集的藻细胞分装于1.5ml 试管中，甩去残余水分，-20保存备用。临用前取出，用灭菌的PBS重新悬浮均匀后方可使用。2）多克隆抗体制备 开始免疫之前将处理好的藻细胞用0.5ml PBS重悬，混匀，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，乳化程度尽量完全。家兔通过四肢的腋下注射、背部皮下多点注射的方式进行免疫。初次免疫剂量分别为共生甲藻为1107个、链状亚历山大藻1107 和2105个和赤潮异弯藻1107个细胞，加强免疫过程中，除佐剂换为弗氏不完全佐剂和免疫剂量减半外，其它步骤不变。免疫原为等体积的PBS藻细胞悬液和弗氏佐剂的混合物，每间隔十天加强免疫一次，共注射80d。利用肥达氏反应测得两种抗体的效价后，放血，收集血液，4静置血块收缩, 2000r/min，离心5min ,提取血清，-20保存备用。3）封闭吸附处理 取赤潮异弯藻抗血清100l，加900l无菌PBS稀释，依次与108个塔玛亚历山大藻、108个共生甲藻的细胞混合，放置于20振动孵育，与每种藻的孵育时间均为2h，然后12000r/min, 离心10min，收集上清，保存备用；按照类似的方法，换用共生甲藻的抗血清与108个塔玛亚历山大藻、108个赤潮异弯藻的细胞混合放置于20振动孵育，与每种藻的孵育时间均为2h，然后12000r/min离心10min，收集上清，保存备用;换用链状亚历山大藻的抗血清与108个赤潮异弯藻、108个共生甲藻的细胞混合放置于20振动孵育，与每种藻的孵育时间均为2h，然后12000r/min离心10min，收集上清，保存备用。4）抗血清效价的测定抗血清效价的测定主要采用间接酶联免疫法（亓海刚等，2006）。海藻或海藻粗提液包被(105106ind/m1)，100 l / 孔，4湿盒过夜；洗板，用0.5%PBST洗3次，蒸馏水冲洗2次，甩干残存液体；封闭，用1%的BSA，包被缓冲溶液稀释，120l/孔，37，3h或者4过夜；洗板，0.5%PBST洗3次，蒸馏水冲洗2次，甩干残存液体；加入海藻的多克隆抗体梯度稀释溶液，1001/孔，37，1.5h ；再洗板，用0.5%PBST洗6次，蒸馏水冲洗2次，甩干残存液体；加入酶标二抗的稀释溶液，100l/孔，37，1.5h：洗板，0.5%PBST洗6次，蒸馏水冲洗2次，甩干残存液体;加入底物OPD溶液，1 00 l/孔，37，15 min；2mol/LH2SO；终止反应，50l/孔：酶标仪读取A492值。将满足条件P(待检血清)/N(阴性对照血清)2.1，且P(待检血清)0.2的显色孔判为阳性，并将抗血清的效价定义为与50%固相抗原结合时抗血清的稀释倍数。）多克隆抗体特异性的测定 海藻或海藻粗提液包被(105106ind/m1)，100 l/孔，4湿盒过夜;洗板，0.5%PBST洗3次，蒸馏水冲洗2次，甩干残存液体;封闭，用1%的BSA，包被缓冲溶液稀释，120l/孔，37，3h或者4过夜；洗板，0.5%PBST洗3次，蒸馏水冲洗2次，甩干残存液体；加入已知细胞密度的藻细胞溶液的梯度稀释溶液50l孔和抗血清的稀释溶液50l孔，37，1.5h，0.5PBST冲洗3遍后加入HRP一羊抗兔IgG，37，15h，0.5PBST冲洗3遍，加入OPD显色液，100 L孔，37，15 min，2mol/LH2SO；终止反应，50l/孔：酶标仪读取A492值。2. 实验结果1）多克隆抗体与自身藻种反应效价的测定 图1图3 是利用间接酶联免疫法对制备的种多克隆抗体经吸附封闭处理前及处理后的效价进行测定结果。未经吸附处理的赤潮异弯藻、共生甲藻效价分别达到1:32000、1：10000以上，显示是高亲合力的抗体；吸附处理后的赤潮异弯藻和共生甲藻的抗体效价达到1:10000和1：7500以上，经过吸附处理后的两种多克隆抗体的特异性明显提高，而效价有所下降。未吸附处理的链状亚历山大抗体藻抗体效价达到1:2500，相比另两种藻的效价较低，吸附处理后的链状亚历山大藻抗体效价达到1：1000，也体现出特异性提高的趋势；虽然吸附处理后效价比未吸附处理的抗体效价有所下降，但已经能够满足试验要求。图1 赤潮异弯藻抗体效价测定图2 共生甲藻抗体效价测定图3 链状亚历山大藻抗体效价测定2）多克隆抗体特异性的测定利用间接竞争酶联免疫法对制备的多克隆抗体的特异性进行测定结果见图4图6。赤潮异弯藻多克隆抗体可以产生竞争抑制作用，并呈现吸光信号梯度，共生甲藻、链状亚历山大藻、硅藻（Bacillariophyta sp）的竞争抑制曲线比较平直，说明它们同赤潮异弯藻多克隆抗体几乎没有交叉，隐藻(Cryptophyta sp)与赤潮异弯藻的多克隆抗体有一定的交叉反应；共生甲藻多克隆抗体可以产生明显的竞争抑制作用，与赤潮异弯藻、硅藻、隐藻、链状亚历山大藻无交叉反应，特异性好；链状亚历山大藻多克隆抗体可以产生竞争抑制作用，与共生甲藻、赤潮异弯藻、硅藻、隐藻、塔马亚历山大藻(Alexandrium tamarense)无明显交叉反应，特异性较好。图4 赤潮异弯藻多克隆抗体特异性检测图5 共生甲藻多克隆抗体特异性检测图6 链状亚历山大藻多克隆抗体特异性检测3.讨论研究结果表明，赤潮异弯藻的抗体效价较高，这可能是由于赤潮异弯藻细胞个体较小（长825m，宽615m），细胞相对表面积较大，可以暴露出更多的抗原表位（Lin et al.,2003），从而刺激免疫动物产生了更多的抗体；共生甲藻细胞个体相对较大（长2052m，宽1744m），刺激免疫动物产生的抗体效价相对较低；链状亚历山大藻细胞个体最大（长2042m , 宽2840m），产生抗体效价与前两种藻抗体相比较低，为提高产生抗体的效价，我们曾经用高细胞剂量免疫，由于该藻产生神经毒素，采用高剂量免疫时家兔死亡，而用低细胞剂量免疫产生的抗体效价较低。由于制备的多克隆抗体可能存在交叉反应，因此采用封闭吸附的方法去除交叉反应，抗体的特异性明显提高，而效价则有所下降（Mendoza,et al.,1995）。利用种藻细胞制备的多克隆抗体所建立的间接竞争酶联免疫检测赤潮藻细胞，该方法灵敏度高，特异性较好；赤潮异弯藻多克隆抗体与隐藻有一定的交叉反应，与其它几种藻细胞无明显交叉反应，说明异弯藻与隐藻表面存在相似的抗原表位。共生甲藻多克隆抗体与其它几种藻无交叉反应，说明共生甲藻与这几种藻细胞表面结构差异明显。利用链状亚历山大藻多克隆抗体对亚历山大藻属内不同种的检测，表明该方法可以作为该属内不同种的鉴定方法。整个实验过程操作简便，利于快速检测并采用多克隆抗体比单克隆抗体效价要高，虽然单克隆抗体特异性更高但制备难度大，成功率不高，多克隆抗体更有利于大量制备，获得相应的检测试剂。免疫学技术具有特异、灵敏和简便的优点，并且费用低，而且技术较为成熟。因此，应用于赤潮的定性、定量研究具有很大的潜力(Sako et al.,1995)。参考文献亓海刚，米铁柱，辛泽毓，李荣秀，于志刚. 2006.赤潮异弯藻抗体的制备及酶联免疫检测方法的建立.海洋学报, 28(5):168171向军俭 ， 朱小兵 ， 吕颂辉. 2003.五种赤潮藻单克隆抗体的制备.暨南大学学报 (自然科学版)，24(3):103108 周名江，朱明远，张 经2001.中国赤潮的发生趋势合研究进展J生命科学， 13(2)：5459Hallegraeff G M, Aanderson D M, Cembella A D. 1995. Manual on Harmful Marine Microalgae IOC Manuals and Guides , UNESCO Publishig , No.33 ParisRehnstam-holm A S,Godhe A, Anderson A M .2002. Molecular studies of Dinophysis(Dinophyceeae)species from Seweden and North America.J.Phycologia, 41:348357Caron D A, Dennett M R, Moran D M, et a.l, 2003. Development and Application of a Monoclonal-Antibody Technique for Counting Aureococcus anophagefferens, an Alga Causing Recurrent Brown Tides in the Mid