资源预览内容
第1页 / 共3页
第2页 / 共3页
第3页 / 共3页
亲,该文档总共3页全部预览完了,如果喜欢就下载吧!
资源描述
免疫组化试剂验证试验记录表仪器、设备:移液器、免疫组化笔、微波炉或高压锅、计时器、孵育湿盒、染色架、 盖玻片、光学显微镜、洗瓶等。溶液配制:PBS溶液配制;EDTA组织抗原修复液及DAB显色液使用详见免疫组化 试剂盒产品说明书操作步骤。实验温度:15-28C实验步骤:1. 脱蜡水化1)石蜡切片置于新鲜的二甲苯中,浸泡15 minx 2次;2)去除多余的液体后,置无水乙醇中,浸泡3 min x 2次;3)去除多余的液体后,置95%乙醇中,浸泡3 min ;4)去除多余的液体后,置85%乙醇中,浸泡3 min ;5)自来水冲洗1 min ;6)PBS溶液冲洗3 minx 3次。2. 加热EDTA抗原修复液(试剂1,采用微波进行抗原修复)1)将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯(或修复盒)中的耐高温塑料切片架上;2)加适量的修复液1x EDTA抗原修复液,(溶液1,用纯净水稀释20倍后)于烧杯中,液面要浸过切片组织一定高度;3)微波炉先用高档加热使液体沸腾,当加热至沸腾时调到中档,此时开始计时,修复时间一般为20 min,此过程中勿使组织干片(修复液要足量);4)将烧杯从微波炉中拿出,放入冷水中冷却降温;5)当修复液降至室温后取出玻片用PBS( PH7.4 )冲洗3 minx 3次。 注意:抗原修复时,修复液务必保证切片始终浸泡在液体内,一般情况:修复 液的量为800 mL/1架-1500 mL/3架;取出玻片,用PBS冲洗时,切勿对着组织冲洗,以免弄破组织。3. 阻断内源性过氧化物酶1)用吸水纸擦干玻片,免疫组画笔在组织周围画圈;2)将3%的过氧化氢(试剂2 ),滴加100 pL到切片组织上以阻断内 源性过氧化物酶,室温孵育15 min ;3)PBS 冲洗 3 min x 3 次。4. 封闭用吸水纸擦干玻片,滴加正常山羊血清(试剂3 ),室温封闭15 min , 以减少非特异性染色。5. 一抗孵育1)用吸水纸擦干玻片组织周围的液体;2)滴加单克隆抗体(试剂4)100 pL,如果做阴性对照实验,就在对 照组的组织上滴加PBS作为阴性对照,置于湿盒中室温孵育1h或4C孵育过 夜。6.复温1)样本4工过夜从冰箱拿出后需在室温下孵育15 min复温(抗体孵育 为4工过夜选用此步骤,如室温孵育直接进入下一步清洗);2)PBS 冲洗 3 min x 3 次。7. 加聚合物辅助剂(试剂5)1)吸水纸擦干切片后滴加试剂5 ( Polymer Helper),室温或37工孵 育 20 min ;2)PBS 冲洗 3 min x3 次。8. 二抗孵育1)吸水纸擦干切片后滴加试剂6(Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG ),室温或 37C孵育 20 min ;2)PBS 冲洗 3 min x 4 次。9.显色1)甩去PBS液,吸水纸擦干切片;2)每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液100 pK试剂7试剂8=1:49 比例配置),孵育3-5 min,光学显微镜下观察染色结果,切勿显色过深;3)显色后用自来水冲洗切片终止显色。
网站客服QQ:2055934822
金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号