大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定关键词： 大黄 蒽醌类成分 提取 2012-08-27 09:01 来源：丁香园 点击次数： 344概述 大黄记载于神农本草经等许多文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一位很早就被各国药典所收 载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatclm L)，大黄(R. officinale Baill)及唐古特大黄(R. tangutium Maxim.et Regli)的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蔥醌类化合物以及它们与糖所 形成的苷。已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种：0H 0 0HR：名称晶形熔魚-H-COOH大黄酸(Rhein)黄色针晶-OH大萤素(Emodin)橙色鈴聶23425/CH-CH:OH芦荟大黄素橙色细针晶206Tsophanol)金色片状结196C晶大黄中蔥醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH,酸 性最强；大黄素连有0H,酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-0H,酸性第三； 大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-0CH3 和-CH3，后者只连 有-CH3,因而后者酸性排在第四位。实验目的和要求1 学习缓冲纸色谱的基本操作技术，并能根据色谱结果，设计液液萃取法分离 混合物的实验方案。2. 掌握PH梯度法的原理及操作技术。3通过磷酸氢钙柱色谱分离大黄酚及大黄素甲醚的试验，进一步熟悉柱色谱操 作技术。4学习蒽醌类化合物鉴定方法。实验方法1. 大黄总蔥醌苷元的提取犬貧粗務(100)攻浴叵流4hr,过鴻，就冒滤液体积二戟渣範倉提戴液450ml)注意：大黄中的蔥醌类成分大部分与糖结合，以蔥醌的形式存在于植物组织中。 所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂，用 苯时应注意苯蒸气的挥发，严防中毒；所得的氯仿液中如带有酸水液，应该用 分液漏斗分出弃去，并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取。氯仿提取 液放置中如有沉淀析出，可滤取之，该沉淀多为大黄素，余液进行下一步分离试 验用。2. 总蒽醌苷元分离方案的设计1) 大黄总蒽醌苷元的纸色谱2) 蒽醌类成分的缓冲纸色谱试验3) 最佳萃取剂及其用量的确定4) 蒽醌类成分各种萃取剂用量的确定5) 新分离方法的设计3. 蒽醌类成分的分离与精制 大黄酸的分离与精制将含有总游离蔥醌的氯仿液450ml移至1000ml的大分液漏斗中，加PH8缓冲 液 275ml 振摇萃取，静置至彻底分层，放出氯仿液后，到出碱水液至置 250ml 烧杯中，加HCI酸化至PH=3，待黄色沉淀析出完全后，过滤、干燥，干燥后的 样品加冰醋酸10ml加热使溶，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸， 过滤即得纯品。 大黄素的分离与精制将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中，用PH9.9缓冲液275ml振摇萃取， 彻底分层后，分出碱水层，并用HCI酸化至PH=3，析出棕黄色沉淀，过滤，沉 淀经干燥后，用 10ml 冰醋酸加热使溶，趁热过滤，析出橙色大针晶，过滤后， 即得大黄素纯品。 芦荟大黄素的分离和精制余下氯仿液移至分液漏斗后，加5%NaCO3:5%NaOH (9:1)碱水液540ml或用 0.5%KOH540mI振摇萃取，碱水液加HCl酸化，析出的沉淀过滤干燥，用10ml 乙酸乙酯重结晶，得黄色针晶的芦荟大黄素纯品。 大黄酚和大黄素甲醚的分离-磷酸氢钙柱色谱4蒽醌类成分的鉴定1) 纸色谱鉴定2) IR光谱解析本实验讲解要点及注意事项1) pH梯度萃取的原理及注意事项。2) 如何设计萃取分离方案的程序与方法。3) 蒽醌化合物红外光谱的特点。4) 分离萃取时一定注意乳化层的分出，不要混入，并且每步最好用新鲜CHCI3, 回洗碱水液。5) 缓冲液的配制和碱液的配制要准确，严格注意检查。6) 每步萃取时，利用纸色谱检查跟踪萃取效果，如未达到预想效果应及时纠正。大黄可减轻内毒素性低血压，消除氧自由基，降低再灌注期血浆、肺、小肠等内 源性一氧化氮的水平，降低肠、肝、肺毛细血管通透性，减轻内毒素引起的肠壁 血管通透性增加，防止肠道细菌移位及内毒素进入血循环等等。临床可用于严重 创伤、感染性休克、MODS等危重病预防及治疗胃肠功能衰竭。我们的经验：生 大黄30克煎成100ml,灌肠或口服，100ml,l-3次/日，亦可灌肠和口服并用。 直到肠鸣音恢复开始减量 大黄含有蒽类衍生物、苷类化合物、鞣质类、有机酸 类、挥发油类等。1. 蔥类衍生物分为：游离蔥醌衍生物，如芦荟大黄素(aloe emodin)、 土大黄素(chrysaron)、大黄酚(chrysophanol)、大黄素(emodin)、异大 黄素(isoernodin)、虫漆酸 D (laccaic acid D) 大黄素甲醚(physcion)、 大黄酸(rhein):结合蔥醌化合物，有大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚的单和 双葡萄糖甙；大黄素、大黄素甲醚的单糖甙；蒽酚和蒽酮化合物：大黄二蒽酮(rheidin)、掌叶二蔥酮(palmidin)以及与糖结合的貳如番泻貳(sennoside) A、 B、 C、 D、 E、 F 等。2. 苷类化合物：土大黄貳(rhaponticin)、3， 5,4-三羟基芪烯一4 -0-0 -D- (6 -O-没食子酰)葡萄糖貳(3, 5，4 -trihydroxy-stilbene 一4 -O-0 -D- (6 -O-gallayl) -glucoside)、3， 5，4-三羟基茋烯 -4 -O-0 -D-吡喃葡萄糖貳(3, 5，4 -trihydroxystilbene-4 -0-0 -D-glucopyranoside）。3. 萘衍生物：torachrysone-8-0-0 -D-glucopy ranoside,torachrysone-8- （6 -oxaly） -glucoside 及决明松（torachryson）。4. 鞣质类：没食子酰葡萄糖、d-儿茶素、没食子酸、大黄四聚素（tetrann） 等。大黄四聚苯经水解，得没食子酸、肉桂酸及大黄明（rheosmin）。此外合有 树脂。尚含有有机酸：苹果酸、琥珀酸、草酸、乳酸、桂皮酸、异丁烯二酸、柠檬 酸、延胡紊酸等。大黄中还含有挥发油、脂肪酸及植物甾醇等。本品横切面：根木栓层及皮层 大多已除去。韧皮部明显；薄壁组织发达。形成层成环。木质部射线较密，宽2 4列细胞，内含棕色物；导管非木化，常1至数个相聚，稀疏排列。薄壁细胞含 草酸钙簇晶，并含多数淀粉粒。根茎髓部宽广，其中常见黏液腔，内有红棕色物； 异型维管束散在，形成层成环，木质部位于形成层外方，韧皮部位于形成层内方， 射线呈星状射出。粉末黄棕色。草酸钙簇晶直径20160m,有的至190m。 具缘纹孔、网纹、螺纹及环纹导管非木化。淀粉粒甚多，单粒类球形或多角形， 直径345m,脐点星状；复粒由28分粒组成。取本品粉末少量，进行微量升华，可见菱状针晶或羽状结晶。取本品粉末0.1g，加甲醇20ml浸渍1小时，滤过，取滤液5ml,蒸干加水 10ml使溶解，再加盐酸1ml,置水浴上加热30分钟，立即冷却，用乙醚分2次提 取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液。 另取大黄对照药材0.1g,同法制成对照药材溶液。再取大黄酸对照品，加甲醇制 成每1ml含1mg的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录WB）试验，吸取 上述三种溶液各4l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层 板上，以石油醚（3060C）-甲酸乙酯-甲酸（155:1）的上层溶液为展开剂，展 开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色 谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置 上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。【检查】土大黄苷 取本品粉末0.2g，加甲醇2ml,温浸10分钟，放冷，取上清液10l, 点于滤纸上，以45%乙醇展开，取出，晾干，放置10分钟，置紫外光灯（365nm） 下检视，不得显持久的亮紫色荧光。干燥失重 取本品，在105C干燥6小时，减失重量不得过15.0%（附录IX G）。总灰分不得过10.0%（附录X K）。酸不溶性灰分不得过0.8%（附录X K）。【含量测定】照高效液相色谱法（附录W D）测定。色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇 -0.1 %磷酸溶液（85:15）为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄素峰计 算应不低于1500。对照品溶液的制备 精密称取大黄素、大黄酚对照品各5mg，分别置50ml量 瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取大黄素溶液1ml、大黄酚 溶液2ml，分别置25m l量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（大黄素每1ml中 含4g、大黄酚每1ml中含8g）。供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约O.lg同时另取本品粉末测定 水分（附录IXH第二法），精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称 定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀 滤过，精密量取续滤5ml，置50ml圆底烧瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶 液10ml，超声处理5分钟，再加氯仿10ml，加热回流1小时，冷却，移置分液 漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取 2次，每次约8ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，氯仿液移至100ml锥形瓶 中，挥去氯仿，残渣精密加甲醇10ml，称定重量，置水浴中微热溶解残渣，放 冷后，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法 分别精密吸取上述两种对照品溶液与供试品溶液各5“l，注入液相 色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含大黄素（C15H10O5）和大黄酚（C15H10O4）的总量不得少 于 0.05。大黄中有多种游离蒽醌及其苷类,总含量约 2-5%。主要有大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大 黄素、大黄素甲醚以及它们的葡萄糖苷等。从大黄中提取分离游离蒽醌时,先用 20%硫酸加 热使苷类水解，保留滤饼，滤饼用乙醚加热回流提取总蒽醌苷元（游离蒽醌），提取液作 TLC 鉴识。 实验对象实验对象实验对象实验对象:大黄滤饼主要仪器主要仪器主要仪器主要仪器、试剂试剂试剂试剂:电热套、圆底烧瓶、冷凝管、乙醚、硅胶薄层板、石油醚 乙酸乙酯 实验操作步骤实验操作步骤实验操作步骤实验操作步骤 : 总羟基蒽醌苷元 的提取：取干燥滤饼，放入100ml圆底烧瓶中，加入乙醚50ml,回流提取3-4小时，得乙 醚提取液。 乙醚提取液经薄层层析检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚 和大黄酚。薄层板为硅胶G-CMC-Na,展开剂为石油醚（60-90C）乙酸乙酯（7：3）, 直立展开。实验注意事项实验注意事项实验注意事项实验注意事项: 加热回流时电热套电压小于50v。取石油醚（60-90C） 7ml，乙酸乙酯3ml,混合均匀。控制点样量，注意点样斑点位置。仔细观察斑点、溶剂前沿移动距