2023 版：高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用标准化专家共识全文宏基因组下一代测序 mNGS 技术直接针对标本中核酸无偏倚检测 病原微生物序列。但是， mNGS 需经标本前处理、核酸提取、文库制 备、上机测序、数据库比对、报告生成及结果解读等一系列过程，对 技术平台及人员素养要求较高。 为标准 mNGS 技术在感染性疾病诊断中的应用，提高危急重症、疑难感染性疾病和发突发传染病的救治水平，在多项国家科技专项的支持下， 本领域有关专家起草了本共识，以促进 mNGS 技术的标准应用和良性进展。 快速准确的微生物鉴定技术始终是临床微生物关注的焦点。传统微生物检验，诸如形态学、培育、抗原抗体及靶向核酸检测等方法在解决疑难及未知病原微生物上存在局限性1, 2 。型宏基因组下一代测序metagenomics next-generation sequencing ，mNGS 技术直 接针对样本中全部核酸进展无偏性测序，结合病原微生物数据库及特 定算法，检测样本中含有的可能病原微生物序列。随着该技术的社会经济本钱不断降低和技术的不断完善，已渐渐从科研走向临床应用，成为临床疑难和未知病原微生物检验的重要手段3。利用 mNGS 技术进展病原微生物检测需经样本前处理、核酸提取、文库制备、上机 测序并满足测试的质量掌握要求后，承受特定算法软件与专用的病原微生物数据库进展比对，实现对病毒、细菌、真菌、寄生虫及非经典及发突发传染病的病原体觉察具有独特价值6, 7 。微生物等的检测 1， 4, 5 。mNGS 技术不依靠培育，对常见病原微生 物检验阴性、阅历治疗失败、不明缘由的危急重感染的病原学诊断以16，组织本领域有关专家起草了本共识，以促进mNGS 技术的规为进一步标准 mNGS 技术在感染性疾病诊断中的应用， 提高危急重症 和疑难感染性疾病的诊疗水平，在多项国家科技专项的支持下，参考 国内外相关文献、共识与标准 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ，特别借鉴了高 通量测序技术临床检测标准化应用北京专家共识第一版通用局部 范应用和良性进展。本共识中声明的内容为专家争论并推举的要点。 一、临床应用的根本要求 一适应证基于医学决策的 mNGS 病原微生物检测申请， 一般用于传统检验方法未能给出明确病原学结果从而影响患者准确诊疗的感染性疾病、发 突发传染病、验证常规检验结果或排解其他发热疾病。推举临床通过 拟诊先行传统微生物检验及聚合酶链反响 polymerase chain reaction ，PCR 检测拟诊疑似常见病原微生物，不盲目使用mNGS技术。在必要或紧急状况下，如危急重症、疑难感染、群体性感染事件等，可考虑作为一线检测方法。 表 1 列出了 mNGS 临床应用适应性说明。临床上在选择 mNGS 进展病原微生物确认时应留意如下事项。1. mNGS 检测申请表： mNGS 检测试验室应供给适合临床使用的申请表。除患者根本信息外，申请单应包括标本类型、拟诊、现病史、既往史、流行病学史、关注的病原体、抗菌药物使用史等。另外，申 请表中应列出不同测序工程及适用范围供医生选择。2.靶向基因测序：基于高通量测序技术的病原微生物检测，除无偏倚的 mNGS 外，还包括原核生物的16S rRNA 基因、真菌 5S rRNA基因两端的 ITS1 、ITS2 及 25-28S rRNA 基因中的 D1 及 D2 区等 以及特定病原微生物靶基因等17。如疑心沙眼衣原体可选momp 主要外膜蛋白基因 ， 疑心结核分枝杆菌 Mycobacterium tuberculosis ，MTB 可选 rpoB 等靶向基因测序 18, 19, 20, 21 。临床医生通过测序试验室供给的工程清单项选择择适宜的工程，切忌大撒网式排查。 3. DNA 测序与 RNA 测序的选择：mNGS 技术理论上可检测以核酸为遗传物质的全部病原微生物。假设临床上已排解病毒感染，可直接进展DNA 测序。考虑到 DNA 测序受人源基因组影响较大，为避开因死亡中的 DNA 和 RNA 进展测序。 mNGS 技术本身是一种核酸检测技术，由于不同微生物类别本身构造差异，其核酸释放效率差异明显，尤其微生物 DNA 残留影响现症感染推断， 可进展 RNA 测序14，22, 23 。当疑心病毒感染， 尤其对呼吸道、 脑脊液cerebrospinal fluid ，CSF 及血液标本，或临床表现简单，无特定疑心方向时，需要同时对样本 是真菌、分枝杆菌等核酸提取需要特定的破壁处理，对于疑似真菌或 分枝杆菌感染时也应特别提出，在检测过程中增加必要的样本处理过 程。 4.mNGS 技术的局限性：受临床mNGS 技术本身、测序本钱及数据库等影响， 常规 mNGS 策略常无法获得样本中全部微生物的序列，临床标本中低浓度致病微生物可能会漏检，同时针对特定的耐药或毒力基因的分析亦较难实现 5。假设需要对耐药基因或毒力基因进展分请者如有特别要求应加以注明。析，可以承受特定方法去除局部人源宿主核酸以提升微生物基因组比 例，或者结合耐药相关基因或毒力基因进展靶向捕获富集后进展。申二标本类型及采集标准类别微生物核酸的提取效率。理论上，凡存在于临床标本中的病原微生物均可通过mNGS 检出，但该技术的准确性依靠标本中微生物的核酸质量及含量，也依靠于不同1.血液及高凝标本：持针器肘静脉采集 35 ml试验室供给专用采血 管，即游离 DNA 样本保存管， 内含乙二胺四乙酸ethylene diamine tetraacetic acid ，EDTA 抗凝剂和保护剂，可抑制血浆中核酸酶及 有核细胞中DNA 的释放。采血时皮肤需彻底消毒，采血至刻度，上下颠倒混匀 510 次，条码标记或编号。切忌在输液处或导管处采集血标本。此外，高凝状态的关节液、胸腹腔积液，甚至 CSF 也可采 用此方法。假设增加 RNA 测序应同时采 2 管。2.支气管肺泡灌洗液及痰液：严格按操作规程采集支气管肺泡灌洗液bronchoalveolar lavage fluid，BALF ，弃去前段可能污染的部分，回收 10 ml 置无菌螺帽管塑料或玻璃质地均可中，内含支气管末梢和肺泡中的分泌物。咳痰标本需在医护人员帮助下，患者用生理盐水漱口 23 次，弯腰 90，用力咳出深部痰35 ml 置无菌螺帽 或编号。管中。假设无法自行咳痰，可通过吸痰器从气道采集。咽拭子只适用于 呼吸道病毒检测。检查容器有无渗漏，紧盖后封口膜密封，条码标记3.CSF 、房水及其他体液：经专科医生标准化采集方法获得，无菌螺 帽管封口膜密封。 CSF留取第 2 管或第 2 管后标本、关节腔积液、胆汁等检测病原微生物 DNA 或 RNA 需采集 1 ml，如同时进展 DNA及 RNA 测序应采集 2 ml。房水至少采集 200 l。骨髓单独进展 DNA或 RNA 测序， 0.5 ml 标本即可，假设同时进展DNA 及 RNA 测序则至少采集 1 ml。这些临床标本采集困难，切记防污染，避开经引流管 采集。胸腹腔积液需富集后提核酸，至少采集 10 ml 24。4.脓肿及深部组织： 1开放性脓肿需清创后采集深部伤口或溃疡基底局部泌物拭子置无菌管中。 2封闭的脓肿需对病灶局部的皮肤或黏膜外表彻底消毒，注射器抽取脓液，假设少于 3 ml，应采集最大标本 量送检。3深部组织感染需手术取材，置于无菌螺帽瓶中。多数情 况下组织中病原微生物含量低于脓液，尽可能取脓肿边缘组织。5.粪便标本：至少黄豆粒大小的颖标本，稀便35 ml ，置螺帽容器中。6.标本转运：假设标本在 24 h 内到达试验室并开头检测，可考虑冰袋低 温运输；假设运输时间在 2472 h 内，应干冰运输，并马上进展标本前 处理和核酸提取；血液标本 4 冰箱保存不得超过 7 d专用采血管，在运输过程中避开猛烈晃动；其他临床标本如需长期保存，应按如下原则执行： 1DNA 测序： -20 保存不超过 7 d。 2RNA 测序：应置-80 。3避开标本反复冻融，一般不得超过 3 次。4 理论上 -80 可长期保存。 5假设疑心高致病性或发突发传染病， 严格依据国内传染病法等相关法律要求包装及转运。尽可能在医院生 物安全防护条件下抽提核酸后再送测序。建议 1 原则上，临床疑心病原微生物感染，常规方法未得到明确病原 学证据而影响临床救治时， 可利用 mNGS 进一步确认。鼓舞临床在排 除常见病原微生物后有目的选择 mNGS 。申请单应填写临床表现、症 状体征、治疗经过、现病史、流行病学史及既往史等。测序试验室应让申请者知晓不同类型感染性疾病的标本选择、采集时机、采集方式、送检量、转运及储存条件、不同 mNGS 检测策略的适用范围。疑为传 染病应符合国家相关生物安全标本采集及转运要求。申请者可提出重 点关注的病原体，如呼吸道病毒、结核分枝杆菌、真菌及寄生虫等。 试验室应供给适宜临床使用的申请单， 内容应包括不同 mNGS 测序策略及对应的适应证。三报告解读原则目前病原微生物确实认照旧遵循 Koch 法则，即：1该微生物存在 并可从被接种的动物体内分别到此微生物。4该微生物可引起每一个个体发病 25。但是，作为一种临床检验方法，利用mNGS 确于同类疾病患者中，安康个体则无此微生物。 2该微生物必需能够 被分别、培育、纯化。3该微生物接种于易感动物可引起一样疾病， 认的感染病例并不能够完全满足传统 Koch 法则，作为该法则的补充， mNGS 具有如下特征。 1. mNGS 结果分析：理论上，凡存在于标本中的微生物均可检出，但因不同类型微生物基因组长度和测序平台等差异，导致无法针对全部微生物建立统一的阴阳性判读标准 7， 26, 27, 28 。试验室应依据 预期用途、标本类型、检测目标和技术特点，建立并验证阳性阈值及 判读标准。原则上 mNGS 的临床意义同核酸检测。另外，打算一个序 列是否来自于某种微生物，很大程度上取决于用于比较的参考微生物序列数据库，假设数据库中未包括该物种以及与其进化距离较近物种的基因组序列可能造成结果不准确。2. mNGS 结果确认：假设检出的微生物符合疾病特征则可能是引起感染的病原微生物，但不能只从序列数多少确认，需考虑序列在基因组上的掩盖度、特异性及保守性 11， 14 。该病原微生物可通过 PCR等方法得到验证， 如呼吸道标本中的流感病毒、 腺病毒及冠病毒等；粪便标本