化妆品中 7 种染发剂的检测方法(征求意见稿)1 适用范围本方法规定了化妆品中酸性紫 43(CAS：224-618-7，CI 42510 )；碱性紫 14(CAS： 632-99-5, CI42510)；酸性橙 3 (CAS： 228-921-5)；碱性黄 87 (CAS： 116844-55-4)； 碱性蓝 26 (CAS： 2580-56-5, CI44045)；碱性红 51 (CAS： 12270-25-6)；碱性橙 31(CAS： 97404-02-9) 7 种染发剂含量的高效液相色谱测定方法。本方法适用于染发类和烫发类化妆品中碱性红 51、碱性紫14、酸性紫 43、碱性 蓝 26、碱性橙 31、酸性橙 3、碱性黄 87 等7 种染发剂含量的测定。2 方法提要试样经甲醇超声提取后，过0.45pm滤膜，采用高效液相色谱系统分离，紫外检 测器或二极管阵列检测器进行检测,外标法定量。若取 5.0g 样品,本方法对碱性红 51、碱性紫14的检出限为0.06mg/kg；酸性紫43、碱性蓝26的检出限为0.6mg/kg； 碱性橙31、酸性橙3的检出限为1.2mg/kg；碱性黄87的检出限为3.0mg/kg；最低定 量浓度分别为：碱性红51、碱性紫14： 0.2mg/kg、酸性紫43、碱性蓝26为2.0mg/kg； 碱性橙31、酸性橙3为3.5mg/kg；碱性黄87为10mg/kg。3 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为色谱纯，水为一级水。3.1 甲醇。3.2 四氢呋喃。3.3 乙酸铵：分析纯。3.4乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取1.54 g乙酸铵(3.3),加水至1000 mL，溶解， 经 0.45pm 滤膜过滤。3.5 染发剂标准物质：酸性紫43 (Acid Violet 43， CAS： 224-618-7， CI 42510 )；碱 性紫 14 (Basic Violet 14, CAS： 632-99-5, CI42510)；酸性橙 3 (Acid Orange 3, CAS： 228-921-5) 碱性黄 87(Basic yellow 87 ， CAS： 116844-55-4) 碱性蓝 26(Basic Blue 26, CAS： 2580-56-5, CI44045)；碱性红 51 (Basic red 51, CAS： 12270-25-6)；碱 性橙 31 (Basic orange 31, CAS： 97404-02-9)；纯度均90%o3.6染发剂混合标准储备液(1.0 mg/mL)：分别称取7种染发剂标准物质(3.5) 0.1 g（精确至O.lmg）于100 mL容量瓶中，甲醇（3.1）稀释定容。3.7 染发剂混合标准系列溶液：分别移取一定量的 2 种染发剂（酸性紫 43；碱性紫14）标准储备液（3.6）,用甲醇配制成浓度为5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0yg/mL 的标准系列溶液；分别移取一定量的 5 种染发剂（酸性橙 3 ；碱性黄87；碱性蓝 26； 碱性红51；碱性橙31）标准储备液（3.6），用甲醇配制成浓度为1.0、 2.0、 4.0、 6.0、 8.0、lO.Opg/mL的标准系列溶液。4仪器与设备4.1 高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。4.2分析天平：感量分别为0.1 mg和1.0 mg。4.3 超声波清洗器。4.4 涡旋混匀器。4.5有机微孔滤膜：0.45pm。5分析步骤5.1 样品预处理准确称取试样5.0g（精确至1mg）于25ml比色管中，加入1.0 ml四氢咲喃（3.2）, 再加入20ml甲醇（3.1）,涡旋振荡2min,在超声提取30min后，放置至室温，用甲 醇（3.1）定容，摇匀，过0.45pm滤膜，待测。5.2色谱参考条件色谱柱：C18柱，250mmx4.6mm （内径），5pm；或相当者。流动相：A相（甲醇）+B相（0.02mol/L乙酸铵（pH=4.0）,梯度洗脱程序见 表1。流速： 1.0 mL/min柱温：30 C进样量： 10pL检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器检测波长：碱性蓝26为616 nm ；碱性红5 1 、碱性紫1 4 、酸性紫43为520 nm； 碱性橙31、碱性黄87、酸性橙3为480 nm。表 1 梯度洗脱程序时间，min流动相A （%）流动相B （%）05951030702580203580205.3测定本方法采用外标校准曲线法定量测定。以系列标准溶液浓度为横坐标，峰面积 为纵坐标，作标准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。6 计算试样中染发剂的含量（卩g/g）,按式（1）计算：式中：w一试样中染发剂的含量，yg/g；C试样溶液中染发剂的含量，yg/mL；V提取溶液体积，mL；m一样品质量，go7 回收率和精密度多家实验室验证的平均回收率为85.2%109.2%,相对标准偏差小于6%（n=6）。8 色谱图图1在616nm下测得碱性蓝26标准高效液相色谱图碱性蓝 26标准出峰时间为30.389 min图2在520nm下测得碱性红51、碱性紫14、酸性紫43标准高效液相色谱图标准出峰时间:碱性红51为22.383 min；碱性紫14为25.654 min；酸性紫43为30.269min图3在480nm下测得碱性橙31、碱性黄87、酸性橙3标准高效液相色谱图 标准出峰时间：酸性橙31为13.186 min；碱性黄87为22.101 min；酸性橙3为:L- 29.437min化妆品中7种染发剂的检测方法起草说明为更好地服务化妆品安全监管，规范化妆品中禁限用物质检测技术要求，确保 化妆品质量安全，2011年 6 月，国家食品药品监督管理局委托河北省保健食品化妆 品协会开展化妆品中 7 种染发剂的测定 高效液相色谱法方法建立和验证工作， 现就起草工作有关情况说明如下：一、起草的必要性染发剂类化合物主要作用是增加化妆品的色泽，在染发剂等各类化妆品中最常 使用的一类物质。根据化妆品卫生规范2007 版，染发剂属于限用物质或暂时允 许使用染发剂目录，具体限量水平参见规范。根据国内外报道，为了提升产品感官性能，部分企业超量使用染发剂，存在较 大风险。但是，当前仅有苯二胺等染发剂组分的检测技术要求，与现实生产实际使 用种类相差较多，也不能涵盖当前现实使用的在规范目录以外的品种，成为行政监 管的瓶颈问题，本技术要求的开发具有紧迫性和现实意义。为此，需要建立有一种 快速有效地检测化妆品中多种染发剂的方法。本标准的制定宗旨在为化妆品中 7 种 染发剂的测定提供更为准确的实验方法，有力的支撑未来市场化妆品的监管，同时 也能够体现我国化妆品检测的水平和对化妆品监管的力度。二、起草依据及文献（一）化妆品卫生规范2007 版.（二）化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范.（三）The cosmetic Directive of Council European Communities, 76/768/EEC.（四）中国药典 2010 版，第二部 .（五）李英、张琛 . 粉状化妆品中 9 种有机染发剂的高效液相色谱法测定，香精 香料化妆品，2009,12（6）：29-33.（六）孙小颖、李英 . 高效液相色谱法同时测定化妆品中的 9 种水溶性染发剂， 色谱，2009,27（6）：852-855.（七）郭桂媛、林维宣 . 高效液相色谱法同时测定化妆品中的 4 种禁用染发剂， 日用化学工业，2011，41（3）：229-231.（丿八）Rastog I S C, Baiwick V J. Identification of organic colorants in cosmetics byHPLC-Diodearray detection. Chromatographic, 1997,（45）:215-228.三、起草原则 本检测方法兼具先进性、准确性以及可操作性强的特点，采用目前一般检测实 验室普遍具备的分析技术，选择适宜、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测 方法的精确性和重现性。四、起草过程 依据国家食品药品监督管理局检验方法起草的有关要求，参考国家标准起草规 范，该方法起草共分六个阶段：1、任务下达。 2011年 6 月，正式获批开展化妆 品中7 种染发剂的测定 高效液相色谱法方法建立和验证工作，项目组查阅了国内 外相关技术标准和文献资料，调研了国内主要省区的行业情况；2、方法开发。2012 年5 月，完成了该方法的建立工作；3、专家论证。2012 年 6 月，邀请食品、化妆品、 质监等相关行业专家，对方法的可行性和实用性等技术指标以及资料完整性等进行 了论证，专家一致认为该方法准确、简捷、可行，适用于作为标准化的检验方法；4、 方法验证。2012 年 7 月，组织了方法验证单位（河北省药包材所、河北省疾控中心 河北出入境检验检疫局技术中心）的相关负责人和行业专家，召开了验证研讨会， 介绍了检测方法建立过程、详细阐述了该方法的使用范围、原理、试剂材料、仪器 设备、测定步骤等内容，并当场交接了验证技术资料、验证用标准品和样品。三家 验证单位按照签订的验证协议书要求，于 8 月底陆续将验证材料报送，将多家实验 室方法验证材料进行总结和分析；5、审定会。2010 年 9 月向国家食药监局上报全部 项目材料，召开项目审定会，论证该方法的技术指标和文本材料等；6、修改报批。 根据审定会专家意见，对材料进一步补测完善，形成最终报批稿材料上报国家食药 监局。五、重点说明的问题（一）关于体例。本检测方法的体例主要参照现行 2007 版化妆品卫生规范 的卫生化学检验方法的体例，便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作。（二）关于 7 种染发剂。见附页。（三）关于检测方法的建立和验证。经过对化妆品中7 种染发剂样品前处理方法 的选择，分析条件的优化，最终建立了化妆品中 7 种染发剂的液相色谱检测方法。0.050.GM4FI I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Ia.005JD010.0015.0020JD025.D030.DO35.00图1在616nm下测得碱性蓝26标准高效液相色谱图015D-0 30-D2D-Q1D-OflD-10. KIi5JK在520nm下测得碱性红51、碱性紫14、酸性紫43标准高效液相色谱图图3在480nm下测得碱性橙31、碱性黄87、酸性橙3标准高效液相色谱图图2表1 7 种染发剂的出峰时间表染发剂名称碱性红51碱性紫14酸性紫43碱性橙31碱性黄87碱性橙3碱性蓝26出峰时间（min）22.38325.65430.26913.18622.10129.43730.389方法验证表明，本方法中各种染发剂在一定线性范围内均有较好的线性相关系 数（0.999）,具体见表2, 7种染发剂的方法检出限见表3,在5.0mg/kg, 50.0mg/kg 两个添加水平时，提取回收率在85.5104.3%之间，方法回收在84.299.5%之间。 日内精密度在0.834.33%之间（n=6）,日间精密度在1.785.39%之间（n=3）；日 内（24h）和日间（5天）稳定性