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多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程,1902年,Emil Fischer首先开始关注多肽合成,由于当时在多肽合成方面的知识太少,进展也相当缓慢当时合成采用了苯甲酰,乙酰保护,脱去相当困难,而且容易导致肽链断裂。直到1932年,Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护-氨基,该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除,多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代,随着越来越多的生物活性多肽的发现,大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究,因此这一阶段的研究成果也非常丰富,人们合成了大量的生物活性多肽,包括催产素(oxytocin),胰岛素等,同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩,这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段,Fred Sanger发明了氨基酸序列测定方法,并为此获得了1958年的Nobel化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法,并于1980年再次获得了Nobel化学奖,成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年,Merrifield提出了固相多肽合成方法(SPPS),这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法,一出来,就由于其合成方便,迅速,现在已经成为多肽合成的首选方法,随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法,而且也带来了有机合成上的一次革命,并成为了一支独立的学科,固相有机合成(SPOS)。当然,Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield,他经过了反复的筛选,最终屏弃了苄氧羰基(Z)在固相上的使用,首先将叔丁氧羰基(BOC)用于保护-氨基并在固相多肽合成上使用,其可以在酸性条件下定量的脱除,反应也非常迅速,在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基(BOC)方法中,氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基(Bzl),因此也称为BOC-Bzl策略。同时,Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪,并首次合成生物蛋白酶,核糖核酸酶(124个氨基酸)。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂,多肽缩合试剂,氨基酸保护基的研究。1972,Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护-氨基,其在碱性条件下可以迅速脱除,10min就可以反应完全,而且由于其反应条件温和,迅速得到广泛使用,到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基(BOC),成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基(But),因此,也称为FMOC-But策略。同时,在多肽合成树脂,缩合试剂以及氨基酸保护,包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。进入21世纪,随着蛋白质组学的研究深入,对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法,而更多的集中在多肽标记与修饰方法,以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。 多肽化学合成的基本介绍多肽化学合成方法,包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法,现在主要应用在短肽合成,如阿斯巴甜,力肽,催产素等,其相对与固相合成,具有保护基选择多,成本低廉,合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较,液相合成主要缺点是,合成范围小,一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成,还有合成中需要对中间体进行提纯,时间长,工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法,它具有合成方便,迅速,容易实现自动化,而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。1.1氨基酸保护基20种常见氨基酸,根据侧链可以分为几类:脂肪族氨基酸(Ala,Gly,Val,Leu,Ile,),芳香族氨基酸(Phe,Tyr,Trp,His),酰胺或羧基侧链氨基酸(Asp,Glu,Asn,Gln),碱性侧链氨基酸(Lys,Arg),含硫氨基酸(Cys,Met),含醇氨基酸(Ser,Thr),亚氨型基酸(Pro)。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键,直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的,需要进行保护,一般要求,这些保护基在合成过程中稳定,无副反应,合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括:Cys,Asp,Glu,His,Lys,Asn,Gln,Arg,Ser,Thr,Trp,Tyr。需要进行保护的基团:羟基,羧基,巯基,氨基,酰胺基,胍基,吲哚,咪唑等。其中Trp也可以不保护,因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下,有些氨基酸也可以不保护,象,Asn,Gln ,Thr,Tyr。表1 常见3种氨基脱除条件TFAHBr/TFAH2/Pd-CPiperidine/DMFBocyynnZnyynFmocnyny图1 常见3种氨基保护基结构氨基酸侧链保护基团非常多,同一个侧链有多种不同的保护基,可以在不同的条件下选择性的脱除,这点在环肽以及多肽修饰上具有很重要的意义。而且侧链保护基和选择的合成方法有密切的关系,液相和固相不一样,固相中BOC和FMOC策略也不一样,从某种意义上看,多肽化学就是氨基酸保护基的灵活运用与搭配。关于侧链保护基的使用,请参考王德心的固相有机合成原理及应用指南第四章,我们这里主要介绍Cys,Lys,Asp的几种保护基及其脱除方法。Cys最常见的保护基有三种,Trt,Acm,Mob,这三个保护基可以完成多对二硫键多肽的合成。Lys最常见的保护基有:Boc,Fmoc,Trt,Dde,Allyl,这对于固相合成环肽提供了很多正交的保护策略。Asp最常见的保护基有:Otbu,OBzl,OMe,OAll,OFm,同样也提供了多种正交的保护策略。表2 巯基常见保护基简称结构脱除条件TrtTFA,HCl/HOAc,I2/MeOHAcmI2/MeOH,Hg2+MobHF,TFMSA,Hg2+表3 氨基常见保护基简称结构脱除条件TrtTFA,HOAc,HCOOHBocHCl/HOAc,TFA/DCMFmocPip/DMF,NaOH/MeOHDdeH2NNH2/DMFAllylPd(Ph3P)4,吗啉/THF表3 羧基常见保护基简称结构脱除条件OtbuTFA,HOAc,HCOOHOBzlH2/Pd,HF,TFMSAOMeNaOH/MeOHOAllPd(Ph3P)4,吗啉/THFOFmPip/DMF,DBU/DMF1.2多肽缩合试剂目前多肽合成中,主要采用羧基活化方法来完成接肽反应,最早使用的是将氨基酸活化为酰氯,叠氮,对称酸酐以及混合酸酐的方法,但是由于这些条件下,存在氨基酸消旋,以及反应试剂危险以及制备比较复杂,逐渐被后来的缩合试剂取代,按照其结构可以分为两种:缩合试剂主要有:碳二亚胺型,鎓盐型(Uronium)。1.2.1碳二亚胺型主要包括:DCC,DIC,EDC.HCl等。采用DCC进行反应,由于反应中生成的DCU,在DMF中溶解度很小,产生白色沉淀,所以一般不用在固相合成中,但是由于其价格便宜,在液相合成中,可以通过过滤除去,应用仍然相当广泛。EDC.HCl因为其水溶解性的特点,在多肽与蛋白的连接中使用比较多,而且也相当成功。但是该类型的缩合试剂的一个最大的缺点,就是如果单独使用,会有比较多的副反应,但是研究表明如果在活化过程中添加HOBt,HOAt等试剂,可以将其副反应控制在很低的范围。其反应机理如下:图2 DIC活化反应机理1.2.2鎓盐型鎓盐型缩合试剂反应活性高,速度快,现在使用非常广泛,主要包括:HBTU,TBTU,HATU,PyBOP等。该试剂使用过程中需要添加有机碱,如,二异丙基乙胺(DIEA),N-甲基吗啉(NMM),该试剂加入后,才能活化氨基酸。其反应机理如下:图3 TBTU活化反应机理1.3多肽合成方法比较1.3.1液相多肽合成(solution phase synthesis)液相多肽合成现在仍然广泛的使用,在合成短肽和多肽片段上具有合成规模大,合成成本低的显著优点,而且由于是在均相中进行反应,可以选择的反应条件更加丰富,象一些催化氢化,碱性水解等条件,都可以使用,这在固相中,使用却由于反应效率低,以及副反应等原因,无法应用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z两种反应策略。图4液相合成Glu-Trp1.3.2固相多肽合成图5 FMOC固相合成Glu-Trp固相多肽合成现在使用的主要有两种策略:BOC和FMOC两种。BOC方法合成过程中,需要反复使用TFA脱BOC,而且在最后从树脂上切割下来需要使用HF,由于HF必须使用专门的仪器进行操作,而且切割过程中容易产生副反应,因此现在使用受到实验条件限制,使用也逐渐减少。FMOC方法反应条件温和,在一般的实验条件下就可以进行合成,因此,也得到了非常广泛的应用。1.3.2.1固相合成中常用树脂固相合成中树脂,一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料,大小在75-150m,交联度在1-2%之间,现在使用的大多是1%,因为这种交联度下,树脂在DMF,DCM中具有很好的溶胀性能,立体上是一个空间网状结构,反应物分子可以在树脂内部自由移动。树脂中最关键的部分是连接手臂,它一端连接在树脂上,一端作为反应位点。目前广泛使用的树脂有:PAM,MBHA,Wang,2-Cl-Trt,Rink-Amide-MBHA等。其中PAM,MBHA是用在BOC策略中,因为其对酸非常稳定,需要在HF,TFMSA等强酸条件下才能够切割下来。图6 固相合成常用树脂1.3.2.2茚三酮检测固相多肽合成中,主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率,检测方法称为Kaiser方法,其检测结果,如果有游离氨基的时候,显示兰色,或红褐色(pro,ser,His)。Kaiser试剂包括:A,6% 茚三酮的乙醇溶液B,80% 苯酚的乙醇溶液C,2% 0.001M KCN的吡啶溶液配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后,重蒸后再使用。检测过程,取少量树脂,加入A,B,C各2-3滴,100下加热1-2min,如果溶液有兰色,或树脂出现兰色,红褐色,表明还有游离氨基,否则说明连接完全。还有其它检测游离氨基的方法:三硝基苯磺酸法,苦味酸法,溴芬兰法等。图7 茚三酮检测原理1.3.2.3固相合成切割方法固相合成完成之后,必须选择合适的切割试剂将多肽从树脂上切割下来,然后经过冰乙醚沉淀,离心收集沉淀,经过HPLC分离纯化,冷冻干燥得到最后产品。由于选择的树脂不同,氨基酸序列不同,在切割时候,选择的切割方法也不完全相同,一般都是选择酸性条件下切割的条件,对于PAM,MBHA树脂,一般采用HF切割,切割过程中需要添加对甲苯酚,对巯基苯酚,苯甲醚等试剂。而对于Wang,Rink-Amide,Trt树脂,一般采用TFA切割,切割过程中加入,乙二硫醇,苯甲硫醚,水,三异丙基硅烷,苯酚等。这些添加试剂主要作为碳正离子俘获试剂使用,目的是俘获切割反应过程中生成的碳正离子,减少这些碳正离子对部分氨基酸侧链的进攻导致的副反应,比较容易产生副反应的氨基酸有:Trp,Tyr。切割试剂用量一般10-15ml/g树脂。常用的切割配比:HF/p-cresol/p-thiocresol(90/5/5),TFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5),反应一般是在室温条件下2h-4h。1.3.3多肽合成中主要问题1.3.3.1消旋及其反应机理多肽合成过程中,部分氨基酸在活化的过程中会导致不同程度的消旋,特别容易消旋的氨基酸有:Cys,His,Ph
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