第四章 克隆策略与体外重组一、填空题1 克隆策略有三层涵义：(1) 第一层是；(2) 第二层涵义是 ；(3) 第三层涵义就是 。2 假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：(1) (2) (3) 。3 现有的基因克隆策略大体上分为三类： 、-。4 受体细胞的感受态是 。5 DNA 重组连接的方法大致分为四种：(1) (2)(3) (4) 。6 平末端连接法 (blunt end ligation) 的连接效率比黏性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反 应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂，以提高平末端 DNA 连接的效率。常用的凝聚剂是。7 一个细菌的表面大约有 个同 DNA 结合的位点。8. 1984年,Hung和Wesink发现如果两个不同的5黏性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端,即可有效地相互连接：(1)(2) (3)。9. 将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个。10. 将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个。11. 在构建cDNA克隆之前，可以用来富集一特殊的核苷酸序列。做法是用来自于能够 产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切)的过量mRNA 分子杂交。12. 一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用一一技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。13. 只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用可以将这段DNA进行百万倍的扩增。的全部或一部分。14. SD 序列是 mRNA 分子中同结合的序列，其结构特征是15 环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链 DNA 转化效率的 。16 cDNA 技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可以用 为模板通过反转录成一个双链的、无的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。17产生平末端的方法有：（1）3）18不同细菌出现感受态的时期是不同的，如肺炎球菌感受态出现的时期是、而枯草杆菌感受态的出现是在 。19 人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为时吸附 DNA，时摄入 DNA 。20 感受态细胞是可以诱导的，诱导的方法有 、21 影响酶切的主要因素之一是底物DNA,底物的影响包括一22 salI 是识别 6 个核苷酸的酶，其识别切割的理论值是个碱基就有一个切点，但在哺乳动物中，大约才有一个切点。23. 在精简基因组文库中,用标记的同未标记的杂交,最后建成的是库。24. 构建基因组文库时连接方法主要是；而构建cDNA文库，可用或一。25. 将携带有外源基因并能持久传递给子代的动物称为动物，这些外源基因就叫做。26提高重组DNA分子对E. coli的转化效率，通常可采取处理和二、判断题1. 外源基因（或 DNA 片段）插入到某一基因内的位点后，这个基因不再有任何功能。2用不同的产生黏性末端的限制性内切核酸酶分别切割载体和外源DNA，得到的黏性末端是不亲和的黏 性末端。3. 基因组DNA文库是含有某一生物中全部DNA序列随机克隆的克隆群，而cDNA文库是含有某一生物中 所有表达基因随机克隆的克隆群。4. CDNA 克隆较之基因组克隆最重要的优越性就是它们含有一个基因的完整序列。5通过差示杂交后制备的CDNA文库使克隆那些只在特定分化细胞表达基因的几率大为提高。6 在染色体步移中，可通过 DNA 测序知道已到达所感兴趣的基因。7 一旦有了一套已知顺序的基因组克隆，通过从文库中获得覆盖目的突变基因所在基因组区的所有克隆， 就可以进行染色体步移。8 根据遗传连锁作图把基因定位在基因组中是定位克隆的第一步，它为分离特定的人的基因提供了一个 直接而快速的方法。9 人工感受态和自然感受态细胞都能吸收线性和环状单链 DNA。10 人工导入基因和正常染色体基因间的同源重组，可以发生基因置换。11.为了保证重组DNA分子在受体细胞中能够稳定地独立存在下来，通常用rec-r-m-表型的细胞株作为 受体菌。12线性DNA片段被导人哺乳动物细胞后，在细胞内酶的作用下，很快相互连接成重复的DNA大片段， 并能在随机位点整合到染色体中。13 不匹配的黏性末端是不能通过黏性末端连接的。14. 用限制性内切核酸酶切割载体、供体DNA后，要加入EDTA-SDS中止液使限制性内切核酸酶失活，这 样有利于重组连接。15限制性内切核酸酶Bglll识别的序列为AJGATC 丁，BamHI识别的序列为GJGATCC，用它们分别切割载体DNA和供体DNA,不必使酶失活，就可以直接通过黏性末端连接法进行连接。16具有EcoRII末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoRII末端的载体中。17. 不匹配的黏性末端可以通过部分填补后进行连接。18. 低丰度的mRNA不仅拷贝数少，而且种类也少。19. 同聚物接尾法构建重组体，不仅连接效率高，而且也很容易回收插人的片段。三、选择题(单选或多选)1. 重叠群(contig)是一群克隆，在这个克隆群体中各个体()(a) 相互之间重叠(b) 都是来自不同生物的克隆(c) 插入片段位于不同染色体的不同区段(d) 位于同一染色体的不同区段2. 根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中，()是cDNA文库(a) YAC 文库(b) MAC 文库(c) 扣减文库(d) BAC 文库3. 下面关于多克隆位点(multipleclonesite,MCS)的描述，不正确的一句是()(a) 仅位于质粒载体中(b) 具有多种酶的识别序列(c) 不同酶的识别序列可以有重叠(d) 一般是人工合成后添加到载体中4. 部分填补是 DNA 体外重组中常用的一种技巧，填补时应()(a) 控制 DNA 聚合酶的用量(b) 控制酶反应的时间(c) 限制dNTP的种类(d) 注意只能填补载体5. 在下列限制性内切核酸酶中， ()的识别序列中有松弛碱基，选用这种酶时要考虑连接后外源DNA 的插入方向。(a) Hindlll(b) EcoRII(c) BamHI(d) Pstl6. EcoRI切割载体DNA和供体DNA所产生的片段在用于重组连接前要()。(a) 用65C处理510分钟使限制性内切核酸酶失活(b) 用CIP处理载体DNA防止自身环化(c) 进行琼脂糖凝胶电泳监测(d) 上述说法都正确7. 在 cDNA 技术中，所形成的发夹环可用()(a )限制性内切核酸酶切除(b) 用3外切核酸酶切除(c) 用S1核酸酶切除(d) 用5外切核酸酶切除8. 在 DNA 的酶切反应系统中，通常：()(a) 用 SSC 缓冲液(b) 加入Mg2柞辅助因子(c) 加入BSA等保护剂(d) 上述说法中，有两项是正确的9 黏性末端连接法，不仅操作方便，而且()(a) 产生新切点(b)易于回收外源片段(c) 载体不易环化 (d)影响外源基因的表达10在下列表型中，()是基因工程上理想的受体菌表型(a) r+m+rec(b) r-m-rec-(C)r-m-rec+(d) r+m+rec-11关于 DNA 接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确?()(a) 给外源 DNA 添加适当的切点(b) 人工构建载体(c )调整外源基因的可读框(d)增加调控元件12DNA 的结构对转化的影响很大，一般说来，转化效率最高的是：()(a) 完整的线性双链DNA(b) 单链线性DNA(c) 完整的环状双链DNA(d) 开口的双链环状DNA13. cDNA文库包括该种生物的()(a )某些蛋白质的结构基因(b )所有蛋白质的结构基因(c) 所有结构基因(d) 内含子和调控区14下列关于建立cDNA文库的叙述中，哪一项是错误的？()(a) 从特定组织或细胞中提取 DNA 或 RNA(b) 用反转录酶合成mRNA的对应单链DNA(c) 以新合成的单链DNA为模板合成双链DNA(d) 新合成的双链 DNA 甲基化15 下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的? ( )(a)操作方便(b)易于回收片段(c) 易于定向重组 (d) 载体易于自身环化，降低重组率16 关于 cDNA 的最正确的提法是：()(a)同mRNA互补的单链DNA (b)同mRNA互补的双链DNA(c)以mRNA为模板合成的双链DNA (d)以上都正确17关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确?()(a) 具有可诱导性(b) 具有可转移性(c) 细菌生长的任何时期都可以出现(d) 不同细菌出现感受态的比例是不同的四、简答题1. cDNA克隆与基因组克隆有何不同？2. 怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去？3. 有哪些可能的原因使一个基因在DNA库中丢失？4. 简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。5. 一个双链DNA分子(为5突出端)可采用哪些方法使之加上dAlOO120的尾巴？6. 酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构?7. 何谓YAC?主要特性是什么？8. Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里？9. 在构建cDNA文库时，为什么常用GC接尾而不用AT接尾法连接？10. 用限制性内切核酸酶切割DNA后，经电泳检查，发现有拖尾现象，其可能的原因是什么？11. 欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E. coli)中进行表达，克隆时应注意哪些 问题?12. 假定你分离到一个E. coli的Thy-突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计一个方案用P CR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。(注：E. coli野生型的ThyA基因的序列是已知 的)五、问答题1. 如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?2. 何谓定位克隆(positional cloning)?3. 何谓染色体步移(chromosome walking)?4. 在染色体步移中，用哪些方法获得克隆的末端?5. 何谓表型克隆(phenotype cloning)?6. 什么是基因文库?7. 什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基 因库有什么不同?8. 什么是cDNA文库(complement DNA library)?同基因组文库有何差别？9. 黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。10. 什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优缺点？11. 何谓接头连接法(li