二、基因表达载体的构建（核心步二、基因表达载体的构建（核心步骤）骤）先用同一种限制先用同一种限制酶分别切割目的酶分别切割目的基因和质粒，再基因和质粒，再用用DNA连接酶将连接酶将二者连接，形成二者连接，形成重组重组DNA分子。分子。三、将目的基因导入受体细胞（转化）三、将目的基因导入受体细胞（转化）n n常用的受体细胞：常用的受体细胞：n n有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。细胞等。1、受体细胞是植物细胞、受体细胞是植物细胞n农杆菌转化法：农杆菌转化法：主要侵染双子叶植物（伤主要侵染双子叶植物（伤口分泌酚类化合物吸引农杆菌）口分泌酚类化合物吸引农杆菌）n基因枪法基因枪法n花粉管通道法花粉管通道法1）土壤农杆菌法）土壤农杆菌法2）基因枪法）基因枪法3）花粉管通道法）花粉管通道法2、受体细胞是动物细胞、受体细胞是动物细胞n显微注射法显微注射法n注入动物受精卵注入动物受精卵1982年，世界上第一例体型比普通年，世界上第一例体型比普通小鼠大小鼠大1.8倍的转基因超级小鼠诞生倍的转基因超级小鼠诞生3、受体细胞是微生物、受体细胞是微生物n将目的基因导入原核生物的好处是什么？将目的基因导入原核生物的好处是什么？n繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少n要想使重组要想使重组DNA顺利进入细菌细胞内，最顺利进入细菌细胞内，最大的难题是什么？大的难题是什么？n一般用一般用CaCl2处理，改变细胞膜的通透性，处理，改变细胞膜的通透性，使得重组使得重组DNA能够进入细胞。能够进入细胞。四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测转基因生物的检测转基因生物的DNA是否插入目的基因是否插入目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质检测性状检测性状分子分子水平水平个体水平个体水平1、检测目的基因、检测目的基因nDNA分子杂交技术分子杂交技术n提取转基因生物的提取转基因生物的DNAn制作分子探针（目的基因的一段单链序列）制作分子探针（目的基因的一段单链序列）n进行分子杂交进行分子杂交2、检测、检测mRNAn分子杂交技术分子杂交技术4、检测性状、检测性状