1 生物技术实践（选修一）复习提纲【考点一】果酒、果醋的制作1、 果酒制作的原理（1）微生物：（单细胞真核生物）生活习性：，在有氧条件下进行有氧呼吸，大量繁殖；无氧条件下能进行酒精发酵。反应方程式：有氧呼吸（场所：）无氧呼吸（场所：）实际应用在酿酒工业中， 通常 先通气后密封。先通气 的目的是促进酵母菌的有氧呼吸，有利于酵母菌的大量繁殖；密封 使酵母菌进行无氧呼吸，产生酒精，所以制酒阶段装置必须密封。在家庭制作果酒中，葡萄汁装瓶留有 1/3 的空间 ，然后密封（不是无O2） 。一方面为酵母菌的大量繁殖提供适宜的氧气，同时 防止发酵旺盛时，汁液溢出而引起杂菌污染。（2）温度控制酵母菌繁殖的最适温度是20，所以酒精发酵一般将温度控制在。（3）菌种来源葡萄酒的自然发酵， 酵母菌来自于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌， 所以用清水冲洗葡萄时，不要反复多次冲洗。 葡萄酒呈现深红色的原因是随着酒精度数的增加，红葡萄皮的色素进入发酵液 。酿酒工业中，常通过接种优良酵母菌菌种，提高果酒品质。为了分离纯净的酵母菌，可利用酵母菌在缺氧、呈酸性（真菌的最适PH=5.0-6.0，而细菌的最适 PH=6.5-7.5）的发酵液中大量生长繁殖，而绝大多数其他微生物因无法适应这一环境而受抑制的活性，进行筛选。2、 果醋制作的原理（1）微生物：（生物）生活习性：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当 缺少糖源 时，醋酸菌将 乙醇氧化成醋酸。所以，没有喝完的葡萄酒因打开瓶盖适宜的温度下，放置久了会变酸。反应方程式：（2）温度控制：醋酸菌的最适生长温度是3、 果酒和果醋的制作（1）制作果酒和果醋的实验流程挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵醋酸发酵果酒果醋（2）设计果酒和果醋的实验方案：发酵设备的清洗和消毒：对发酵瓶、纱布、榨汁机、盛葡萄汁的器皿等实验用具进行清洗并消毒（先用温水反复冲洗，再用70%酒精查实消毒，晾干待用）选择新鲜的葡萄（500g） ： 先用清水 冲洗 ，再去除枝梗 晾干榨汁，将葡萄汁装入发酵瓶，盖上瓶盖或封闭充气口：（注意发酵瓶留有1/3 的空间 ）精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 11 页2 将发酵瓶置于18-25的温度下发酵，每天拧松瓶盖2-4 次排气（严格控制温度，及时排气，但 不要打开瓶盖）10d 后开始取样检查：酒味、酒精含量、酵母菌数量等（这是观察的指标）果酒制成后，在发酵瓶中缴入醋酸菌或醋曲，将装置移至30-35的条件下发酵，适时向发酵瓶中 充气 （严格控制温度，适时充气）观察检查： 菌膜的形成、 嗅味和品尝进行鉴定，再通过显微镜检醋酸菌的数量做进一步的鉴定（这是观察的指标）（3）比较课本P4，图 1-4a和 1-4b 实验装置，哪个装置更好？还有什么不足？1-4a 1-4b 4a 装置用带盖的塑料瓶制葡萄酒，在发酵过程中每天要拧松瓶盖2-4 次，但不打开盖子 ，以放出 CO2 ，并防止发酵液被污染；10 天可取样检验，如酒味、酒精含量、酵母菌镜检；果酒制成后，可在发酵液中加入醋酸菌或醋曲，再将装置移到30-35的条件下发酵，适时充气或将瓶盖打开，但在瓶口上盖上纱布（减少空气中灰尘等的污染）。不足：制果酒排气和取样时拧松瓶盖，容易受杂菌污染；制果醋没有充气装置。4b 装置中充气口在醋酸发酵时，链接充气泵，进行充气（不是冲O2） ，制酒加料后关闭；排气口用于酒精发酵时排CO2，通过一个 长而弯曲的胶管与瓶身链接，可防止空气中的微生物污染 ，果醋发酵时 排出多余的空气、CO2（有氧呼吸产生的） ；出料口用于取样检验。（4）操作注意事项：选择新鲜的葡萄，榨汁前应先冲洗，然后再去除枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。防止发酵液被污染：榨汁机、发酵装置要清洗干净，严格消毒；装入葡萄汁后，及时封闭充气口；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖控制发酵条件：葡萄汁装入发酵瓶后，要留有1/3 的空间，既保证酵母菌大量繁殖对微量氧的需求，又防止发酵旺盛时汁液溢出；制酒应将温度严格控制在18-25，因为 20左右最适合酵母菌繁殖、生活力强；制醋应将温度严格控制在30-35，因为醋酸菌是嗜温菌，最适温度在30-35。注意葡萄汁中糖的浓度对发酵产生的影响：葡萄汁中加糖的主要目的是提高葡萄酒的酒精度。但不是糖的浓度越高越好，发酵时要注意测定葡萄汁中糖的浓度 ，过高 会引起酒精积累而抑制发酵 ；浓度 过低 会因酒精含量低而引起杂菌生长。（5）结果与评价：结果：随着发酵程度的加深，液体密度会逐渐变低。因为发酵时糖被消耗，一部分产生了水和 CO2，大部分产生了酒精和CO2，水和酒精的密度比糖水低。评价：果酒：发酵后取样， 通过嗅味和品尝进行初步鉴定；还可用显微镜观察酵母菌，并用检验酒精的存在与否（在酸性 条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现）果醋：先观察菌膜的形成、嗅味和品尝进行初步鉴定；再通过检测盒比较发酵前后的PH 作精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 11 页3 进一步的鉴定；还可以通过显微镜检查是否有醋酸菌，并统计其数量。（6）课题延伸如何证实葡萄汁转化成葡萄酒，是由于酵母菌的发酵作用？将葡萄汁 煮沸后冷却 ，重复实验，进行对照。在葡萄酒等果酒的生产中，广泛使用果胶酶和蛋白酶的酶制剂，为什么？果胶酶的应用有利于葡萄的压榨、葡萄汁的澄清、色素的提取和酒的陈酿化。蛋白酶的应用主要是为了促进蛋白质水解，使酒精清澈透明。【考点二】腐乳的制作一、腐乳制作的原理1、 参与腐乳发酵的微生物有， 其中起主要作用的微生物，这些微生物都是真菌，进行孢子生殖。2、经过毛霉菌的发酵，豆腐营养成分发生的变化：毛霉等微生物产生的蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶将脂肪分解成甘油和和脂肪酸。（注意是胞外分解）二、腐乳制作实验1、写出腐乳制作的流程：让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制2、 根据腐乳制作流程和有关资料设计实验，制作腐乳（1）将豆腐切成3cm*3cm*1cm的若干块 （豆腐含水量为左右， 水分过多则豆腐不易成型，过少不利于毛霉的生长，因为毛霉的代谢离不开水）（2）将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内，上面再覆盖干净的粽叶，若气候干燥，可覆盖保鲜膜。（粽叶能提供菌种、保湿，注意豆腐块间留有空隙，保持合适的湿度，毛霉是需氧型微生物）（3）将平盘放入的地方， 约 5 天。 （此温度不适合细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长；表面丛生白色的直立菌丝）（4）毛霉生长旺盛呈淡黄色时，去除上面的粽叶和包裹平盘的保鲜膜，约36h 以上。 （散失热量、水分和霉味）（5）将培养毛坯逐块分层放在容器中，分层加盐，约腌制8d。 （靠平盘的一边未长菌丝靠玻璃瓶边，毛坯与盐量的比为5:1，随层数加高盐量，瓶口表面盐要铺厚些，以防止）（6）将料酒和糖按口味不同而而配以各种香辛料混合制成卤汤。（卤汤酒精含量控制在为宜，酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系：酒精含量过高，抑制蛋白的活性，；含量过低，可能导致豆腐腐败）（7）将干净的广口瓶用高压锅在100蒸汽灭菌30min，将咸坯摆入瓶中，加入卤汤和辅料后，将瓶口用酒精灯加热灭菌，用胶条密封，常温下六个月。（容器严格灭菌、封口防止杂菌进入）3、豆腐长白毛是毛霉的，现代腐乳生产是在严格无菌的条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样做的目的是。4、 吃腐乳时，你会发现腐乳外面有一层致密的皮。这层皮是前期发酵时在豆腐表面生长的菌丝，它能形成腐乳的体，使腐乳成型，皮对人体无害。5、 腐乳制作过程中，加盐腌制的目的是：（1）可以析出豆腐中的水分，使豆腐变硬；精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 11 页4 （2）能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质；（3）使豆腐具有可口的口味；（4）抑制蛋白酶的活性，防止豆腐腐败变质。6、 在腐乳制作的过程中，防止杂菌污染的措施：（1）用于制作的设备要清洗干净，腌制豆腐的瓶子要高温严格灭菌沸水消毒；（2）加盐腌制、卤汤中的酒精和香辛料可抑制微生物的生长；（3）装瓶时，操作要迅速小心，加卤汤后用胶条将瓶口密封，最好在酒精灯旁操作；（4）发酵温度控制在15-18，此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长。7、 会影响腐乳的风味和质量的因素：盐的用量、发酵温度、发酵时间、卤汤的配料等。【考点三】探讨加酶洗衣粉的洗涤效果1、常用的酶制剂种类，作用和适用范围种类作用适用范围蛋白酶使蛋白质水解成氨基酸或小分子多肽催化水解肉、蛋、奶渍和血渍脂肪酶使脂肪水解成甘油和脂肪酸催化水解油脂及皮脂腺分泌物、化妆品污垢淀粉酶使淀粉水解成麦芽糖催化水解酱、粥等污渍纤 维 素酶使纤维素水解成葡萄糖使丝织物增艳， 过量会损伤棉、 麻等天然纤维织物2、比较加酶洗衣粉和普通洗衣粉去污原理的异同：相同：表面活性剂可以产生泡沫，可以将油脂分子分散开；水软化剂可以分散污垢等；不同：酶可以将大分子有机物分解成易于溶于水的小分子有机物，从而与纤维分开。3、在洗衣粉中添加的酶最主要是碱性蛋白酶，使用这种洗衣粉的注意事项：（1）蛋白质类纤维（羊毛、蚕丝）织物不能用加酶洗衣粉洗涤：（使蛋白质水解，纤维受到损伤）（2）注意洗涤用水的温度（碱性蛋白质在35-50时活性最强）（3）不宜长期存放（时间过长会导致酶活力损失）（4）避免长时间接触皮肤（可分解人体皮肤表面蛋白质）4、影响加酶洗衣粉中酶活性的因素有：温度、酸碱度和表面活性剂、有机溶剂等5、为了防止温度、酸碱度和表面活性剂对酶活性的影响，通过一定技术、生产出能耐酸、耐碱、 忍受表面活性剂和较高温度的酶，这种工程技术是基因工程 。加酶洗衣粉中的酶是用特殊的化学物质包裹的，遇水后包裹层很快溶解，释放出来的酶迅速发挥催化作用。这里 未运用酶的固定化技术，因为酶未固定在不溶于水的载体上，也不能重复利用。6、加酶洗衣粉的使用在环境保护方面使洗涤剂向低磷方向发展，减少对环境的污染7、影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有哪些？水温；水量（水量不宜过多，但应该让布料充分浸泡在水中，过多的水会使酶浓度降低，影响洗涤效果） ；水质（如自来水、蒸馏水，一般使用自来水，因为实际生活中使用的是自来水） ；洗衣粉的用量（用天平称比用勺量好）；衣物的质料、大小、颜色（人为在衣物上增加污物，如血渍、油渍等，令人难以接受，选用布料做实验材料比较可行；在作对照实验时，严格控制布料的大小、颜色及污物的量，待污物干燥后再进行实验）；浸泡的时间和洗涤时间要相同；洗涤的方式（小型全自动洗衣机机洗比手洗好；实验中，通常用玻棒搅拌）8、在本课题中可以使用下列方法和标准判断洗涤效果：（检测指标）可在 相同洗涤时间后比较污物的残留状况，如：已消失、颜色变浅、面积大小；去除相同污精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 11 页5 渍所需时间的长短。9、 探究实验（一）不同温度条件下加酶洗衣粉的洗涤效果的探讨：（1）实验原理：温度影响酶的活性，酶有最适温度（2）自变量：（3）因变量：（4）无关变量：水量、水质、洗衣粉用量、洗衣粉种类、衣物质料、大小、浸泡时间、洗涤时间、洗涤方式等。10、探究实验（二）探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果：（1）自变量：（2）因变量：（3）无关变量：水量、水质、水温、洗衣粉用量、衣物质料、大小、浸泡时间、洗涤时间、洗涤方式等。（4）实验组处理：污物+加酶洗衣粉对照组处理：等量的污物+等量的普通洗衣粉11、探究实验（三）不同种类的加酶洗衣粉对同一污渍的洗涤效果（1）实验原理：酶的专一性（2）自变量：（3）因变量：（4）无关变量：水量、水质、水温、洗衣粉用量、衣物质料、大小、浸泡时间、洗涤时间、洗涤方式等。【考点四】酵母细胞的固定化1、 请根据酶的特性，思考为什么酶广泛应用于食品、化工等领域？催化效率高，低耗能，低污染2、 在工业生产酶的过程中，存在哪些实际问题？有什么解决的办法？对环境（强酸、强碱、高温和有机溶剂等）条件非常敏感，容易失活；溶液中酶很难回收，提高了生产成本；反应后酶会混合在产物中，影响产品质量。设想：将酶固定在不溶于水的载体上（固定化酶）3、 固定化酶的使用有什么优点？存在哪些不足？优点： 固定化酶既能与反应物接触，又容易分离，提高了产物质量；固定在载体上的酶可以反复利用。不足： 一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的。4、 固定化细胞使用有什么优点和不足？优点： 成本低、操作容易（细胞比酶分子大），对酶的活性影响小、可以催化一系列反应（固定了一系列酶） 、容易回收 。不足： 大分子物质难以自由通过细胞膜，应用受到限制； 固定后的细胞与反应物不易接近，可能导致反应效果下降等。5、 将酶或细胞固定化的方法（1）包埋法：多用于固定化细胞（酶分子很小，容易从包埋材料中漏出）（2）化学结合法：用于固定化酶（细胞个大，难以结合）（3）物理吸附法：多用于固定化酶（细胞个大，难以被吸附）6、 从操作角度思考，固定化细胞与固定化酶相比，固定化细胞更容易，对酶的活性影响小 ：因为微生物产生的酶分为胞外酶和胞内酶，利用胞内酶时，需要经过细胞破精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 11 页6 碎、酶的提取和纯化的过程，提取后酶的活性和稳定性往往会受到很大影响。将微生物制成 固定化细胞后，可作为固体催化剂在多步酶促反应中发挥连续催化作用，同时催化反应结束后又能被回收和重复利用。7、如果反应物是大分子物质，应采用固定化酶技术，因为大分子物质难以自由通过细胞膜，所以固定化细胞的应用受到限制。8、本课题使用的是包埋法固定化细胞，即将微生物细胞均匀包埋在不溶于水的多孔载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。9、酵母细胞固定化技术的基本步骤：酵母细胞的活化配置CaCl2配置海藻酸钠溶液将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合固定化细胞冲洗凝胶珠酒精发酵10、酵母细胞活化的原因：在缺水状态下，微生物会处于休眠状态，活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。活化酵母细胞用蒸馏水而不用微生物培养液的原因：培养液中的溶质颗粒会一并包埋，影响产品质量。11、溶解海藻酸钠， 应该用酒精灯，边加热边搅拌， 直至海藻酸钠溶化。12、配置海藻酸钠溶液是最重要的一环，海藻酸钠浓度过高，将（不是圆形或椭圆形） ；浓度过低，凝胶珠呈白色，。13、将海藻酸钠与酵母细胞混合前，需将海藻酸钠溶液冷却至室温：14、海藻酸钠与酵母细胞的混合物滴入CaCl2 溶液中， 以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到 0.05mol/L CaCl2 溶液中；其中CaCl2 的作用是。15、形成拖尾的凝胶珠的原因：海藻酸钠浓度过高 ，注射器口离CaCl2 溶液过近 ，注射器滴加 速度过快 等。16、将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗2-3 次的目的：使凝胶珠充分定型17、用固定化酵母发酵过程中锥形瓶密封的原因：酵母菌发酵需要无氧环境18、如何观察固定化酵母发酵的效果？观察气泡的产生、测酒精的生成情况19、为了使固定化酵母细菌能反复利用，操作要注意20、使用固定化细胞应用于工业生产，对发酵液的浓度的要求：发酵液的浓度不宜过高 ，浓度过高， 细胞因失水死亡。【考点五】DNA的粗提取与鉴定1、在真核生物的细胞中，DNA 主要分布在细胞核中，可以用甲基绿将细胞染色，细胞核呈绿色。2、细胞核中的DNA 是游离存在的吗？细胞核中的DNA 与蛋白质和少量的RNA 结合后呈染色质，染色质是遗传物质的主要载体。3、提取 DNA 的思路是什么？DNA 与蛋白质的理化性质有哪些不同？思路：利用DNA 和 RNA 、蛋白质等在物理和化学性质等方面的差异，提取DNA, 去除其他成分理化性质：（1）在不同浓度的NaCl 溶液中的溶解度不同（方法：选择适当的盐浓度，使DNA 充分溶解或沉淀，而使杂质沉淀或溶解）（2）DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质则溶于酒精（在溶有DNA 的溶液中加入等量的体积分数为95%的冷酒精，提取含杂质较少的DNA ）（3）DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA 没有影响；大多数蛋白质不能忍受60-80的高温， 而 DNA 在 80以上才会变性；洗涤剂能瓦精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 11 页7 解细胞膜，但对DNA 没有影响（在含有DNA 的滤液中加能嫩肉粉水解蛋白直或将滤液放在60-75的恒温水浴箱中保温）4、 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度曲线如右图：DNA 在 0.14mol/L 的 NaCl 溶液中，溶解度最小， 在 2mol/L 和 0.015mol/L的 NaCl 溶液中， 溶解度最大。（所以通过加盐和加水的方法，使 DNA 溶解和析出）5、 DNA 在的条件下，遇会被染成6、 DNA 的粗提取的步骤及目的（1）材料的选取：一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中过多过少的损失而造成检测的困难鸡血 ：细胞核的DNA 的含量丰富；鸡血细胞容易吸水涨破（注意：含DNA 的是鸡的血细胞，而不是鸡全血）猪血 ：哺乳动物红细胞内的细胞核和线粒体都消失，没有DNA ，所以不能选用猪血细胞做实验材料提取DNA （因为哺乳动物成熟的红细胞没有核膜和众多的细胞器，即没有核膜和细胞器的膜的混杂，所以是制备细胞膜的好材料）猪肝：肝细胞含有细胞核，有DNA ，但需要匀浆、离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长，不是理想的实验材料。植物细胞（菜花、洋葱）：需要切碎，再加入洗涤剂和食盐，进行搅拌和研磨，过滤收集滤液（洗涤剂溶解细胞膜，食盐有利于研磨，还能溶解DNA ）（2）破碎细胞，获取滤液：在鸡血细胞中加入蒸馏水，搅拌，过滤收集滤液；若在植物细胞中加入洗涤剂盒食盐，充分搅拌和研磨，过滤收集滤液（3）去除滤液中的杂质根据 DNA 的溶解性、对酶及高温耐受性的不同等特性，最大限度的将DNA 与杂质分开。（4）DNA 的纯化加入等体积的95%的冷酒精，静置2-3min ，再用玻棒沿一个方向搅拌（沿一个方向搅拌的目的是防止DNA 断裂），从而析出含杂质较少的DNA 。7、若用鸡血做实验材料，通常不直接用鸡全血，而是在索取鸡血前，在烧杯中提前放入抗凝剂柠檬酸钠，经离心取鸡血细胞进行实验，因为DNA 存在于血细胞中，血浆中没有，这样可以获得更多的DNA 。柠檬酸钠是抗凝剂，具有防止血液凝固的作用。8、为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？鸡血细胞在低渗溶液（蒸馏水）中吸水涨破，释放出DNA 。9、提取洋葱的DNA ，主要包括哪几个步骤？加入洗涤剂和食盐的作用是什么？步骤：称量、剪碎、研磨、过滤洗涤剂：能溶解细胞膜，有利于DNA 的释放 （注意：纤维素酶能溶解细胞壁，洗涤剂能溶解细胞膜）食盐：既有利于充分研磨，也有利于溶解DNA 10、提取洋葱的DNA ，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？提取的 DNA 少，看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定不显蓝色。11、破碎细胞后， 获取的 DNA 滤液中，DNA 和 RNA 往往与蛋白质结合在一起，所以 DNA滤液中可能有核蛋白、多糖和RNA 等成分。方法一：在滤液中加入NaCl （或 2 倍体积的 2mol/LNaCl 溶液）， 使 NaCl 溶液的浓度为2mol/L（DNA的溶解度最大） ，过滤收集滤液，除去不溶的杂质，再调节静置2-3min，再 用玻棒沿一个方向搅拌 （沿一个方向搅拌的目的是防止DNA 断裂），NaCl 的浓度为0.14mol/L（方精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 11 页8 法：加水稀释） ，析出 DNA （DNA 的溶解度最小） ，过滤 取纱布上的黏稠物（不用过滤的方法，采用离心的方法会更好），去除溶于溶液中的杂质。再用NaCl 溶液的浓度为2mol/L 溶液溶解 DNA （简述步骤：滤液加浓盐水过滤加水过滤）方法二：直接在滤液中加嫩肉粉 （含木瓜蛋白酶，能使蛋白质水解成小分子肽，使DNA 和蛋白质分离开来） ，反应 10-15min 方法三：将滤液在 60-75的恒温水浴箱中保温10-15min （蛋白质因变性析出与DNA 分离） ，过滤取滤液12、DNA 与蛋白质分离或蛋白质被分解后，加入等体积的95%的冷酒精 ，静置 2-3min，再用玻棒沿一个方向搅拌（沿一个方向搅拌的目的是防止DNA 断裂）13、在 DNA 提取过程中，两次析出DNA 的方法的比较：第一次析出是利用0.14mol/L 的 NaCl 溶液中溶解度最小，析出DNA 粘稠物， 通过纱布过滤；第二次析出是利用DNA 不溶于酒精 溶液，用玻棒卷起白色的丝状物。14、粗提取的DNA 是白色丝状物15、 DNA 鉴定如何设计对照？为什么要设计对照？取两支试管，各加入2mol/L （最好是0.015mol/L ）的 NaCl 溶液 5ml，在其中一支试管中加入丝状物，搅拌使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml 的二苯胺试剂， 混匀后沸水浴加热，冷却后比较颜色的变化。设计对照的目的排除 NaCl 对鉴定结果的影响。【考点六】微生物的实验室培养和分离1、培养基（1）分类：按物理性质分为液体培养基和固体培养基。（2）成分：一般都含有，除此之外，培养基还需要满足微生物生长对 PH ，特殊营养物质及氧气的要求。如在培养乳酸杆菌 时，需要在培养基中添加维生素 ；培养 霉菌 时需将培养基的PH调至 酸性 ；培养 细菌 时需将 PH调至 中性或微碱性；培养厌氧微生物是则需要提供无氧条件。2、无菌技术获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，重点是：（1）消毒（对实验操作的空间、操作者的衣着和手）煮沸消毒法（在100煮沸 5-6min 可以杀死微生物细胞和一部分芽孢）巴氏消毒法 （适用于 不耐高温的液体，如牛奶，在 70-75 或在 80煮 15min，可以杀死牛奶中的微生物，使牛奶的营养成分不被破坏）化学药剂消毒（用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源）（2）灭菌实验室常用方法：灼烧灭菌，干热灭菌，高压蒸汽灭菌。灼烧灭菌： 接种环、 接种针或其他金属用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底的灭菌；试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。干热灭菌：在160-170 加热 1-2 小时可达到目的，能耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等。高压蒸汽灭菌：将灭菌物品装入高压蒸汽灭菌锅后，把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后，将锅密闭，继续加热使锅内气压逐步上升，温度也随之升到100。为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100kpa，温度为121，维持15-30min。3、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 11 页9 （1）称量时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖，因为牛肉膏和蛋白胨容易吸潮。（2）溶化时将称好的牛肉膏连同称量纸 一同放入烧杯，加入少量水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。溶解过程中， 不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。（3）培养基利用高压蒸汽灭菌法，培养皿一般利用干热灭菌法。（4）待培养基冷却至左右时在酒精灯火焰附近倒平板。锥形瓶的 瓶口通过火焰的目的是： 防止瓶口的微生物污染培养基；平板冷凝后将平板倒置 的原因是： 可以使培养基表面的水分更好的挥发，防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。4、纯化大肠杆菌常用的微生物接种的方法有和。（1）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。灼烧的目的：A操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；B每次划线之前都要灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，从而通过划线次数的增多，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。C划线结束后灼烧接种环能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细污染环境和感染操作者。灼烧接种环后等其冷却 后划线的原因：防止高温杀死菌种第二次及以后划线操作时从上一次末端开始划线的原因：划线后， 线条末端细菌数目比起始处要少， 每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目通过划线次数的增加而减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（2）稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。注意事项：所有操作都要保证无菌。附：培养基的分类和应用划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动，分类和鉴定固体培养基微生物 分离，鉴定，活菌计数根据用途选择培养基培养基中加入了抑制或促进微生物生长的化学物质培养， 分离 出特定微生物鉴别培养基培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别 不同种类的微生物（4）土壤中分解尿素的细菌的分离和计数（一）课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因：土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶3、常见的分解尿素的微生物精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 11 页10 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌（二）研究思路1、筛选菌株实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、 温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基。培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 ，以尿素作为氮源，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。2、统计菌落数目（1）显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。（2）间接计数法（活菌计数法）常用方法：稀释涂布平板法原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌， 通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。每克样品中的菌落数 (CV) M 其中， C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml) ，M 代表稀释倍数。注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30 300 的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中， 经涂布， 培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在 50 个左右为最好。3、设置对照（1）设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度（2）设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素。条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。三、实验的具体操作1、土壤取样：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌 。2、制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基3、样品的稀释分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 11 页11 目的：保证获得菌落数在30300 之间、适于计数的平板结论： 为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。4、分析：如果得到了2 个或 2 个以上菌落数目在30 300 的平板， 则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 11 页