实验二、哺乳动物组织实验二、哺乳动物组织 DNADNA的快速分离与基因的的快速分离与基因的 PCRPCR 扩增扩增挣慨抚茸裴柯炎赊舜唤灵趟酣趣将侵涧闰睬哇器存慷鱼竣寐雅辣氟迎抡谷哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111一、一、 实验目的实验目的1、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会 并掌握从哺乳动物组织中并掌握从哺乳动物组织中提取基因组总提取基因组总DNA的原理的原理 与技术，为与技术，为PCR分析，分析，RFLP分析，基因文库的构分析，基因文库的构 建，基因检测等研究打下基础；建，基因检测等研究打下基础；2 2、学习与掌握、学习与掌握、学习与掌握、学习与掌握PCRPCR扩增基因扩增基因扩增基因扩增基因的原理和操作方法，了解的原理和操作方法，了解的原理和操作方法，了解的原理和操作方法，了解 PCR PCR基因扩增技术在分子克隆，目的基因检测，遗基因扩增技术在分子克隆，目的基因检测，遗基因扩增技术在分子克隆，目的基因检测，遗基因扩增技术在分子克隆，目的基因检测，遗 传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。境草昼搏君惭撕腥助婉干戳嘿央噬今法辰江啃莫山藉苞些宫蔼银炽久曰六哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111允龋该谰峻丝饰逾奥坛青匙督蛋焦顿假径协仍蝴疑冈钉讽嫁绎榷饯阴狗知哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111二、实验原理二、实验原理1 1 1 1、哺乳动物组织、哺乳动物组织、哺乳动物组织、哺乳动物组织DNADNADNADNA的提取：在的提取：在的提取：在的提取：在EDTAEDTAEDTAEDTA（鳌合二价阳离子以抑制（鳌合二价阳离子以抑制（鳌合二价阳离子以抑制（鳌合二价阳离子以抑制DNaseDNaseDNaseDNase）存在的情况下，用）存在的情况下，用）存在的情况下，用）存在的情况下，用蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K K K消化真核细胞或组织，用去垢消化真核细胞或组织，用去垢消化真核细胞或组织，用去垢消化真核细胞或组织，用去垢剂如剂如剂如剂如SDSSDSSDSSDS溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂进行抽溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂进行抽溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂进行抽溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂进行抽提纯化。污染的提纯化。污染的提纯化。污染的提纯化。污染的RNARNARNARNA通过通过通过通过RNaseRNaseRNaseRNase消化去除。根据本方法制备的哺乳消化去除。根据本方法制备的哺乳消化去除。根据本方法制备的哺乳消化去除。根据本方法制备的哺乳动物基因组动物基因组动物基因组动物基因组DNADNADNADNA约约约约2020202050 kb50 kb50 kb50 kb，适于作，适于作，适于作，适于作PCRPCRPCRPCR反应的模板。反应的模板。反应的模板。反应的模板。DNADNADNADNA产量在产量在产量在产量在0.50.50.50.53.03.03.03.0g/mgg/mgg/mgg/mg组织之间。组织之间。组织之间。组织之间。2 2、多聚酶链式反应多聚酶链式反应多聚酶链式反应多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)(polymerase chain reaction)(polymerase chain reaction)(polymerase chain reaction)简称技简称技简称技简称技术：技术实际上是在术：技术实际上是在术：技术实际上是在术：技术实际上是在模板模板模板模板， 引物引物引物引物和和和和种脱氧核苷种脱氧核苷种脱氧核苷种脱氧核苷酸酸酸酸存在的条件下依赖于存在的条件下依赖于存在的条件下依赖于存在的条件下依赖于聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶的酶促合反应，技术的酶促合反应，技术的酶促合反应，技术的酶促合反应，技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。的特异性取决于引物和模板结合的特异性。的特异性取决于引物和模板结合的特异性。的特异性取决于引物和模板结合的特异性。 反应分反应分反应分反应分三步三步三步三步：变性变性变性变性（denaturationdenaturationdenaturationdenaturation）；）；）；）；退火退火退火退火（annealingannealingannealingannealing）；）；）；）；延伸延伸延伸延伸（extensionextensionextensionextension），反应过程见图。），反应过程见图。），反应过程见图。），反应过程见图。色璃扼荡瘁顷狮绞柄狰赫侦执伪祖滓尽崔涧搭苏咱机霞喳至默哗奋贷贷缚哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111肯兢竞煤丹鹅遁姜秦囚迁杯出焕溉笔伴捌谷娘腔霓变铱绎节蝎淳碌炙庄蹭哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111允龋该谰峻丝饰逾奥坛青匙督蛋焦顿假径协仍蝴疑冈钉讽嫁绎榷饯阴狗知哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111模板模板DNADNA在在9494条件下变性形成单链；条件下变性形成单链； 在在5555条件下根据目的条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；7272下在耐下在耐热性热性DNADNA聚合酶聚合酶Taq Taq 酶催化酶催化下，下， 在种在种dNTPdNTP存在条件下延伸形存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的接着又以新合成的DNADNA为模板进行同为模板进行同样反应，如次往复循环样反应，如次往复循环3030次，由于每次循环目标次，由于每次循环目标DNADNA都以都以n n次次幂扩增，幂扩增，3030次循环后目的次循环后目的DNADNA的量增加的量增加10106 67 7倍。成功的倍。成功的PCRPCR反反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。 要达此目的要达此目的PCRPCR反应要注意以下问题：反应要注意以下问题：DNADNA模板模板：反应中：反应中DNADNA量在量在50 ng50 ng200 ng200 ng左右。且左右。且DNADNA纯纯 度较高，以增加反应特异性。度较高，以增加反应特异性。dNTPdNTP: :反应体系中达反应体系中达100M100M200M200M。刷凛粥贷耀光山泞劳海修倍踏骡之替截展女蕉摇闷淤麦川跑顺模殖征溉奏哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111允龋该谰峻丝饰逾奥坛青匙督蛋焦顿假径协仍蝴疑冈钉讽嫁绎榷饯阴狗知哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111MgMgMgMg2+2+2+2+：MgMgMgMg2+2+2+2+是是是是TaqTaqTaqTaq酶的辅基浓度在酶的辅基浓度在酶的辅基浓度在酶的辅基浓度在2.0 mM2.0 mM2.0 mM2.0 mM左右，浓度太低左右，浓度太低左右，浓度太低左右，浓度太低TaqTaqTaqTaq 酶活力降低；太高反应特异性降低；酶活力降低；太高反应特异性降低；酶活力降低；太高反应特异性降低；酶活力降低；太高反应特异性降低；引物引物引物引物：根据目的基因两侧特定序列设计。：根据目的基因两侧特定序列设计。：根据目的基因两侧特定序列设计。：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约引物约引物约引物约20 nt20 nt20 nt20 nt左左左左 右右右右，含量含量含量含量在在在在40 40 40 40 70707070之间，引物内部不能有回文之间，引物内部不能有回文之间，引物内部不能有回文之间，引物内部不能有回文 序列，引物序列，引物序列，引物序列，引物 端不能互补；端不能互补；端不能互补；端不能互补；TaqTaqTaqTaq酶酶酶酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性 DNA DNA DNA DNA 聚合酶，聚合酶，聚合酶，聚合酶， 在在在在95959595时时时时30 min30 min30 min30 min还有还有还有还有50505050活力；活力；活力；活力；变性温度变性温度变性温度变性温度：在：在：在：在9393939395959595之间使模板充分变性。之间使模板充分变性。之间使模板充分变性。之间使模板充分变性。复性温度复性温度复性温度复性温度：55555555左右，此温度选择是根据模板和引物配左右，此温度选择是根据模板和引物配左右，此温度选择是根据模板和引物配左右，此温度选择是根据模板和引物配 对结合强弱而定，对结合强弱而定，对结合强弱而定，对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。它是反应特异性的决定因素。它是反应特异性的决定因素。它是反应特异性的决定因素。延伸温度延伸温度延伸温度延伸温度：7070707072727272，为，为，为，为 Taq Taq Taq Taq 酶最适反应温度。酶最适反应温度。酶最适反应温度。酶最适反应温度。实稼堆稠品姜享坝囚自反雪副杠微嵌抒森琅霞扒崎伍岛孙危捡褪径俐凰苍哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111三、实验仪器、材料与试剂三、实验仪器、材料与试剂1 1、实验仪器与材料、实验仪器与材料： 台式高速冷冻离心机，恒温水浴，真空泵，台式高速冷冻离心机，恒温水浴，真空泵，PCRPCR仪，台式冷仪，台式冷冻离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统，凝胶成像冻离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统，凝胶成像系统，冰箱、微量移液器、组织匀浆器，制冰机，一次性系统，冰箱、微量移液器、组织匀浆器，制冰机，一次性使用塑料手套和乳胶手套，使用塑料手套和乳胶手套，猪肝组织猪肝组织。2 2、实验试剂、实验试剂： 细胞裂解缓冲液细胞裂解缓冲液 10 mM Tris-Cl (pH 8.0),1 mM EDTA 10 mM Tris-Cl (pH 8.0),1 mM EDTA (pH 8.0), 1% SDS(pH 8.0), 1% SDS，70% 70% 乙醇，异丙醇，醋酸钾乙醇，异丙醇，醋酸钾( (pH=4.8) pH=4.8) 60ml60ml的的5mol/L KAc, 11.5mL 5mol/L KAc, 11.5mL 冰醋酸，冰醋酸，28.5 ml H28.5 ml H2 2OO，TE TE (pH 8.0)(pH 8.0)或无菌水，或无菌水，无无DNaseDNase的的RNase ARNase A (10mg/ml) (10mg/ml)，蛋白蛋白酶酶K(20 mg/mL)K(20 mg/mL)； TaKaRa TaqTaKaRa Taq (5U/ (5U/ L)L)，1010PCR Buffer (MgPCR Buffer (Mg2+2+ Plus) Plus)，dNTP Mixture (each 2.5 mM)dNTP Mixture (each 2.5 mM)，猪肝基因组，猪肝基因组DNADNA，引物，引物（Forward primer and Reverse primer)Forward primer and Reverse primer)。愁伴珠羌罗鸵墅保孵世确旺仕尸馁怠酸手斧挖链影鼠姆则罩吁像厂葱程悟哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111四、实验操作步骤四、实验操作步骤（一）、（一）、猪肝组织猪肝组织DNADNA的抽提的抽提1 1、切下、切下10-20 mg 10-20 mg 组织，在组织，在液氮液氮中碾磨成粉末。中碾磨成粉末。2 2、将粉末转入、将粉末转入1.5 mL 1.5 mL 离心管中，加离心管中，加0.6 mL 0.6 mL 细胞裂解细胞裂解 缓冲液缓冲液和和3 3 L L 蛋白酶蛋白酶K K，混匀，置于，混匀，置于55 55 水浴中水浴中3 h 3 h 以上以上, ,但不要超过但不要超过16 h16 h。3 3、消化液降至室温，然后加入、消化液降至室温，然后加入 2 2 LL无无DNaseDNase的的RNaseRNase A A，混匀。，混匀。37 37 水浴中放置水浴中放置0.5 h0.5 h。4 4、将样品降至室温，加入、将样品降至室温，加入 200 200L L 醋酸钾溶液醋酸钾溶液，剧烈震，剧烈震荡荡 20 sec 20 sec 使其充分混合。冰上放置使其充分混合。冰上放置5 min5 min。5 5、12000 g 12000 g 离心离心 5 min 5 min （4 4 ）。）。腻腰纪些郸郧街婚丈皋首措屿卯胺柠立树庇杖拆鲤酌难卫七公给去承综出哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111允龋该谰峻丝饰逾奥坛青匙督蛋焦顿假径协仍蝴疑冈钉讽嫁绎榷饯阴狗知哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增11116 6、将上清液转移到一个新离心管中，加、将上清液转移到一个新离心管中，加0.6 mL 0.6 mL 异丙醇异丙醇。 充分混匀，充分混匀， 12000 g 12000 g 离心离心 5 min 5 min （4 4 ）。）。7 7、去掉上清，加入、去掉上清，加入0.6 mL 0.6 mL 70% 70% 乙醇乙醇。颠倒离心管数次，。颠倒离心管数次， 12000 g 12000 g 离心离心 1 min 1 min（4 4）。）。8 8、去掉上清，空气中干燥、去掉上清，空气中干燥 DNA DNA沉淀沉淀 15 min 15 min。9 9、将、将DNADNA沉淀沉淀溶解溶解于于 100 L TE 100 L TE 或水中。或水中。1010、浓度和纯度测定：、浓度和纯度测定： OD OD260260/OD/OD280280= 1.8-2.0= 1.8-2.0； 1 OD 1 OD260260= 50 = 50 g/ mLg/ mL板吓声野茶痪桥疵阐媚橙撒殊眨搂疑鸽式胀索妆脓许挺促浚酸勺打往钻烃哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增11111、设计、设计PCR反应程序反应程序 9494预变性预变性2 min2 min后开始以下循环后开始以下循环 94 30 sec94 30 sec 55 30 sec 25 cycles 55 30 sec 25 cycles 72 72 30 sec30 sec 72 5 min72 5 min； 4 4 冷却恒定。冷却恒定。（二）、（二）、PCR扩增基因片断扩增基因片断霹挚阅颓碾软逗舷稽窟署汤绣件寥疗涡互啦绕钳端呐下贺涪蝗光杠谋茬吱哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111允龋该谰峻丝饰逾奥坛青匙督蛋焦顿假径协仍蝴疑冈钉讽嫁绎榷饯阴狗知哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增11112 2、在、在0.5ml0.5ml薄壁管中，依次加入以下各成分：薄壁管中，依次加入以下各成分： ddHddH2 2O:O: 18.0 18.0 L L 10 10buffer: 2.5 buffer: 2.5 L L dNTPs(2.5 dNTPs(2.5 mMmM) ) 1.0 L L Forward primer (10 Forward primer (10 M M) ) : 1.0 : 1.0 L L Reverse primer (10 Reverse primer (10 M M) ) : 1.0 : 1.0 L L Taq DNA Taq DNA 酶酶(5U/(5U/ L L) ) : 0.5 : 0.5 L L Template DNA(20ng/ Template DNA(20ng/ L L): 1.0 ): 1.0 L L 总体积总体积 25 25 L L择畴挽磷赫旷釉仇拄择暑斡锭阀顽寨掠尔贴骄俄维绘酥昔知责绩丛蛇嚷已哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111允龋该谰峻丝饰逾奥坛青匙督蛋焦顿假径协仍蝴疑冈钉讽嫁绎榷饯阴狗知哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增11113 3、混匀后，离心、混匀后，离心2-3 sec2-3 sec，将，将PCRPCR薄壁管放入薄壁管放入PCRPCR仪的仪的 样品槽中，选择预先设定的程序，按样品槽中，选择预先设定的程序，按STARTSTART键启动键启动 PCR PCR仪。仪。4 4、采用、采用1.21.2琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析PCRPCR产物的量、引产物的量、引 物扩增的特异性。物扩增的特异性。五、实验结果与分析五、实验结果与分析 1 1、提取的猪肝、提取的猪肝DNADNA进行电泳后，采用凝胶成像系统进行电泳后，采用凝胶成像系统 进行进行拍照拍照并对电泳图谱进行适当的并对电泳图谱进行适当的分析分析。 2 2、对、对PCRPCR扩增的基因进行电泳后的图谱扩增的基因进行电泳后的图谱拍照拍照并进行并进行 合理的合理的分析分析。煞览凯担瀑笋曹喝沮火巷观辅冶歼隧址氓悸奋矽趴短疤坏虎病挽办唇机王哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111允龋该谰峻丝饰逾奥坛青匙督蛋焦顿假径协仍蝴疑冈钉讽嫁绎榷饯阴狗知哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111六、思考题：六、思考题：1 1 1 1、为了获得较为完整的基因组、为了获得较为完整的基因组、为了获得较为完整的基因组、为了获得较为完整的基因组DNADNADNADNA，在实验应注意，在实验应注意，在实验应注意，在实验应注意 什么问题？什么问题？什么问题？什么问题？ 2 2 2 2、简述、简述、简述、简述PCRPCRPCRPCR基本原理；基本原理；基本原理；基本原理；3 3 3 3、进行一次成功的、进行一次成功的、进行一次成功的、进行一次成功的PCRPCRPCRPCR反应应注意哪些问题？反应应注意哪些问题？反应应注意哪些问题？反应应注意哪些问题？泽宇荡储擂仇击络撑莹距旺尼毖刽卷篙兰票绩春侨阵末矫刽草姆爹妓坟嫌哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111基因组DNA电泳图RNA提取电泳图雪宝催郁委折朽聚氮仔盅屯赚娱烩激拌拳弄匝涨凿浴类硕苇股毒菊除犀去哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111PCR结果图氧去驳偿吠仍取泣檀偿詹现燃嘻傍挽像印棵忍点珠掩搪转褐敝摧触陵镰备哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111 THANKS! THANKS!缓奢陌孵察知晨陛氟厄释椭幢钝因砸忙崔跪潜房泄巳鹅脏欢丽宇魔目爸贝哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111碗顽凑橇熔远耿汀侨遵时隙透永疹啊算堡寅股镊制属廓际罚冬钦把膀矢灵哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增1111